DVT患者外周血差异表达circRNA的筛选验证及互作网络分析

来源 :昆明医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:lzltgp
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[目的]深静脉血栓形成(DVT)是骨科大手术后较常见的并发症,尤其是髋膝关节置换术后,由于患者腿部静脉血流瘀滞、内皮损伤以及凝血级联异常激活,没有抗凝治疗的情况下,DVT发病率明显提高。针对DVT分子生物学水平的调控机制,国内外进行了许多研究,发现一些微小RNA(miRNA)与DVT发生发展相关,但其调控网络需进一步发掘完善。随着对非编码RNA(ncRNA)深入研究,发现环状RNA(circRNA)在血栓性疾病领域具有较强的创新意义,为临床诊疗提供了新的研究方向。本项研究通过circRNA芯片技术检测DVT患者与对照组外周血中circRNA的表达,筛选出差异表达的circRNA。采用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)选定circRNA对芯片结果进行验证。通过生物信息学(Bioin-formatics)手段,包含基因本体(GO)分析和基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析预测差异表达circRNA的功能。为候选circRNA构建circRNA-miRNA-mRNA预测网络,丰富miRNA数据。为寻找特异性强、灵敏度高的分子标志物 以预测DVT发生、监测DVT进程、评估病情及预后提供一定基础。[方法]1.根据纳入排除标准,结合双下肢彩色多普勒血管超声诊断,收集了 2019年2月至2019年12月于昆明医科大学第一附属医院就诊的10例DVT患者作为DVT组(实验组),其中6例男性,4例女性,平均年龄66.5±3.27岁;收集了同期于昆明医科大学第一附属医院就诊的10例无DVT患者作为对照组,其中5例男性,5例女性,平均年龄65.1 ±2.54岁。DVT包括胫前胫后静脉、腓静脉、腘静脉和股静脉的血栓。2.随机选取DVT组3例研究对象,对照组3例研究对象,采集外周静脉血,分别提取两组外周血样本的总RNA,去除核糖体RNA及线性RNA后,使用circRNA芯片技术,检测DVT组和对照组样本的circRNA表达情况。3.将两组样本实验结果归一化处理,进行统计分析,比较两组样本间的表达差异。对两组间差异表达的circRNA基因分层聚类分析及可视化处理。4.选定差异表达最显著的前5位circRNA对芯片检测结果进行验证。具体为:分别采集DVT组和对照组各余下的7例研究对象外周静脉血,提取总RNA,进行qRT-PCR实验,检测两组样本中circRNA表达量,验证circRNA芯片检测结果。5.选择完成验证的5位circRNA中差异最显著的circRNA,通过Arraystar基于miRanda和TargetScan数据库自制miRNA预测软件,以及miRNA靶标预测软件,构建该circRNA的circRNA/miRNA/mRNA作用网络,通过生物信息学分析其功能。6.使用SPSS 19.0软件统计数据,计量资料用均数(mean)±标准差(SD)表示,采用T检验评价结果的显著性,p<0.05表示两组的差异有统计学意义。[结果]1.用于筛查两组样本间circRNA表达差异的6个样本(即3个DVT组样本,3个对照组样本)的实验结果数据归一化强度近似相同分布,6个样本log2-ratio的分布相似。2.基因分层聚类分析显示,两组样本的circRNA表达有差异。3.与对照组相比,circRNA在DVT患者中有不同的表达模式。统计分析表明两组样本间circRNA的差异表达有统计学意义(fold change>2.0,p<0.05)。4.与对照组相比,DVT组样本中有303个circRNA表达失调,其中83个表达上调,220个表达下调。5.差异表达的circRNA大部分为外显子型circRNA,主要转录来源为chr1、chr2、chr12 和 chr10。6.qRT-PCR 实验结果显示,DVT 组样本中 hascirc000455、hascirc101515、hascirc101212 表达水平升高,hascirc000185、hascirc001982 表达水平降低。7.对差异表达circRNA进行生物信息学分析显示,与生物过程、细胞成分和分子功能密切相关的术语分别是蛋白转运、细胞质和ATP结合。最显著富集的途径为:胸腺激素信号通路、肿瘤内吞作用、蛋白多糖、Fc-r介导的吞噬作用、局灶性粘附激酶信号通路、胰岛素信号通路、p53信号通路、抗生素生物合成、上皮细胞细菌侵袭、AMPK信号通路。8.hascirc000455 的预测 miRNA 靶标为 hsamiR20b3p、hsamiR223p、hsamiR225p、hsamiR1385p 和 hsamiR559。9.qRT-PCR 检测结果显示,DVT组样本中 hsamiR20b3p、hsamiR223p、hsamiR559表达下调。10.miRNA靶标预测软件预测有652个靶点与hsa circRNA000455相互作用,其中313个靶基因与hsa-miR-138-5p相互作用,相互作用网络最大;229个靶基因与hsa-miR-22-3p相互作用,呈第二大相互作用网络。[结论]1.DVT患者外周血差异表达最显著的circRNA:circ000455、circ101515、circ101212表达水平升高,circ000185、circ001982表达水平降低。2.DVT 患者外周血中 circ000455 的预测靶向 miRNA:miR225P、miR1385p表达水平升高,miR20b3p、miR223p、miR559表达水平降低。3.生物信息学分析示:circRNA000455/miR-22-3p/NLRP3可能参与DVT发展。
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