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研究目的:探讨细胞外信号调节激酶1/2（Extracellular signal regulated kinase,ERK1/2）信号通路在II型糖尿病心肌缺血/再灌注（Ischemia/reperfusion,I/R）损伤中的作用机制及靶向干预效果。探讨外源性靶向转导组成性激活的MEK1基因（Constitutively active MEK1,Ca MEK）能否通过激活ERK1/2信号通路,减少线粒体分裂、改善线粒体功能、抑制心肌细胞凋亡等方面减轻II型糖尿病心肌缺血再灌注损伤。研究内容:1)高糖高脂肪饲料饲养C57BL/6J小鼠并注射链脲佐菌素（Streptozocin STZ）建立II型糖尿病小鼠模型,观察缺血后适应在C57BL/6J小鼠和II型糖尿病小鼠中的心肌保护作用的差异以及对ERK1/2信号通路活性的影响;2)细胞水平上,采用H9C2心肌细胞,建立高糖和缺血、缺氧、复氧（Hypoxia/reoxygenation,H/R）的模型,探讨Ca MEK基因减轻高糖心肌缺血再灌注损伤的作用机制。3)建立II型糖尿病小鼠在体心肌缺血再灌注损伤模型,在组织及动物整体水平上探讨II型糖尿病小鼠心脏靶向转导Ca MEK基因对抗II型糖尿病心肌缺血再灌注（Ischemia/reperfusion,I/R）损伤的作用。研究方法:1)首先选取8周龄的C57BL/6J雄性小鼠为研究对象,给予高脂高糖饲料喂养4W,给予腹腔注射链脲佐菌素（STZ Streptozotocin）,注射剂量为50mg/kg,建立II型糖尿病小鼠模型。对照组小鼠给予用常规饲料喂养。在喂养8周后检测II型糖尿病小鼠空腹血糖水平,确定成功构建II型糖尿病模型,对C57BL/6J小鼠和II型糖尿病小鼠建立在体缺血再灌注和缺血后适应（Ischemia post conditioning,IPost C）模型,检测心肌梗死面积,以及ERK1/2信号通路中相关蛋白的表达等指标。2)在H9C2心肌细胞中给予ERK1/2激活剂或转染Ca MEK基因,然后给高糖刺激建立高糖模型和缺血、缺氧、复氧刺激建立缺血/缺氧/复氧损伤模型,流式细胞仪检测法检测细胞凋亡,Mitotracker检测线粒体分裂和融合状况,JC-1检测线粒体膜电位,Mito-SOX检测氧化应激,蛋白免疫印迹法（Western blot）和免疫荧光检测ERK1/2信号通路相关蛋白、线粒体分裂相关蛋白、以及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。3)分别对8周龄的、给予常规饲料喂养的C57BL/6J的雄性小鼠和给予链脲佐菌素注射加同时给予高脂高糖饲料喂养的II型糖尿病小鼠,经尾静脉分别注射ds AAV9-e GFP及ds AAV9-Ca MEK病毒载体。转染4周后,建立在体的心肌缺血/再灌注损伤模型。主要检测指标为心肌梗死面积、心肌细胞凋亡指数、心功能的评价、血清心肌酶的测定、氧化应激水平、ERK1/2信号通路关键蛋白的表达。研究结果:1)缺血后适应能够显著降低C57BL/6J小鼠的心肌梗死面积,对C57BL/6J小鼠心肌具有一定的保护作用,主要是通过激活C57BL/6J小鼠心肌的ERK1/2信号通路起作用的。但是在II型糖尿病小鼠心肌中,缺血后适应没有保护作用,I/R组和IPost C组的心肌梗死面积无明显差异（P＞0.05）,主要是因为缺血后适应（IPost C）不能够有效激活II型糖尿病小鼠心肌的ERK1/2信号通路。2)同时给高糖刺激和缺血缺氧/再灌注后,H9C2心肌细胞的凋亡比率与高糖组相比更进一步升高,且具有显著性差异（P＜0.05）。但是,高糖缺血再灌注组ERK1/2蛋白磷酸化水平并没有进一步增加。给予ERK1/2激活剂或转染Ca MEK基因后,能显著激活ERK1/2蛋白磷酸化表达水平和显著降低心肌细胞凋亡比率（P＜0.05）。给予ERK激活剂或转染Ca MEK基因后,高糖心肌缺血再灌注引起促凋亡蛋白Bax表达水平降低,抑制凋亡蛋白Bcl-2表达水平升高,Bcl-2/Bax的比值升高。Mitotracker结果显示转染Ca MEK基因后,高糖心肌缺血再灌注组点状线粒体个数进一步减少,平均网络结构大小增加,分支长度中位数增加,差异有统计学意义（P＜0.01）,网络结构大小的中位数和平均分支长度增加,差异有统计学意义（P＜0.05）。蛋白免疫印迹法结果提示线粒体分裂蛋白Drp1s616位点磷酸化表达水平降低,免疫荧光结果提示减少了线粒体分裂。JC-1结果提示线粒体膜电位升高。Mito SOX结果提示减少氧化应激水平,以上结果表明给予ERK激活剂或Ca MEK基因激活ERK1/2信号通路可以减少线粒体分裂,提高线粒体膜电位,改善线粒体功能,减少氧化应激,减轻高糖心肌缺血再灌注损伤。3)对于在体缺血再灌注损伤（I/R）研究,发现体内转导Ca MEK基因可有效激活II型糖尿病小鼠心肌缺血再灌注损伤心肌ERK1/2信号通路,明显降低了II型糖尿病小鼠心肌梗死面积、减少心肌细胞凋亡指数和心肌酶水平,差异有统计学意义（P＜0.05）。而且,体内转导Ca MEK基因在有效激活II型糖尿病小鼠心肌缺血再灌注损伤心肌ERK1/2信号通路后,减少了线粒体损伤和梗死面积,减轻了心肌细胞凋亡,减轻糖尿病心肌缺血再灌注损伤。结论:1)ERK1/2信号通路没有有效激活是导致缺血后适应对II型糖尿病小鼠心肌缺血再灌注（I/R）损伤没有保护作用的主要原因。2)通过给予ERK激活剂或转染Ca MEK基因能够激活H9C2心肌细胞ERK1/2信号通路,减少线粒体分裂,提高线粒体膜电位,降低氧化应激水平,稳定线粒体功能,抑制促凋亡蛋白表达水平,增加抑凋亡蛋白表达水平,减少心肌细胞凋亡,减轻高糖心肌缺血再灌注（I/R）损伤,Ca MEK基因靶向转导有望成为高糖心肌抵抗缺血/再灌注损伤的有效手段。3)给予Ca MEK基因可以明显激活II型糖尿病小鼠ERK1/2信号通路,有效减少心肌梗死面积和心肌细胞凋亡,降低心肌酶的水平,降低氧化应激水平,从而减轻II型糖尿病缺血再灌注损伤。