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目的:β-受体阻滞剂(Beta-blockers)是一系列具有手性特征的药物,其中阿替洛尔(Atenolol,AT)为选择性β1受体阻滞剂,临床用于治疗高血压、心绞痛及心律失常,也用于治疗青光眼。阿替洛尔化学名为2-[4-[2-Hydroxy-3-(isopropylamino)propoxy]phenyl] acetamide,因其分子中有一个手性中心,存在着一对对映异构体(enantiomers),目前临床上使用的制剂均以S和R对映体各半混合的外消旋体(racemate)形式给药。但是,这两种对映体不仅在药理作用的类型、强度而且在生物体内的吸收、分布、代谢等方面都存在显著差异,其S型的心脏β阻断活性是R型的46倍。近年来,有关阿替洛尔在临床治疗中的副作用多有报道,并由此引起了关于β受体阻滞剂是否应该从一线药物中撤除的热烈讨论。因此,研究阿替洛尔两种光学异构体的分子作用机制的差别有着重要的理论和实际意义。蛋白质组学与药学的学科交叉逐渐形成新的研究领域--药物蛋白质组学。其研究内容在临床前包括:发现所有可能的药物作用靶点,以及针对这些靶点的全部可能的化合物。也包括应用蛋白质组学方法研究药物作用机制和毒理学;在临床研究方面包括:药物作用的特异蛋白作为患者选择有效药物的依据和临床诊断的标志物,也可应用类似于药物遗传学的方法,按照蛋白质谱来分类患者,给予个体化治疗,并预测药物疗效。二维凝胶电泳和质谱的结合与精致的生物信息学建立了一套强有力的、通用的方法,为药物蛋白质组学研究提供了技术支持。本文以阿替洛尔(R),(S)对映异构体作用于血管平滑肌细胞提取的蛋白质为研究对象,以双向电泳技术初步分离蛋白质,再对差异表达蛋白点进行酶解,通过HPLC-CHIP富集、分离酶解肽混合物,线性离子阱质谱途径在线鉴定差异蛋白,以求对阿替洛尔对映异构体与靶蛋白间的相互作用和β-受体阻滞剂类手性药物作用机制有更深入的了解,从而为手性药物的开发提供全新的研究策略和实验依据。方法:蛋白样品的制备:将VSMC在DMEM培养液中,含胎牛血清(FBS)10%、37℃、5%CO2、湿度为90%的环境中培养。达到细胞对数生长期时改用含有阿替洛尔和阿替洛尔的培养液中培养液培养。运用MTT法测定药物细胞毒性,以确定作用药物浓度。接种对数生长期的细胞于96孔板,待细胞处于对数生长期用不含有血清分别含消旋的阿替洛尔0、0.15、1.5、15、30、60、120、μmol/L的培养液孵育细胞4小时后弃去培养液,用5 mg/mLMTT的PBS溶液作用4小时后吸出所有溶液用100μL DMSO溶解,590nm扫描酶标仪测定数据。双向电泳:分别用120μmol/L的R-阿替洛尔和S-阿替洛尔处理细胞4小时后,用刮取法收集细胞,按照用水化上样缓冲液Ⅱ提取细胞全蛋白,-80℃保存各蛋白样品。均用固相pH胶条(17cm,pH3~10)进行分析。200μg蛋白样品在重泡胀液(7mol/L尿素,2mol/L硫脲,4%CHAPS,30mmol/L DTT,0.5%IPG缓冲液,痕量溴酚蓝)中重悬,被动水化过夜(12~16h)。之后进行双向电泳(一向:IEF;二向:12% SDS-PAGE电泳),根据Bio-Rad双向电泳实验指南进行。2-DE的分离结果用经典质谱兼容银染法染色后进行图像扫描,以PDQest7.4.0图像分析软件分析凝胶并寻找差异点。根据差异分析结果,两种样品中的同一种蛋白质如存在1.5倍以上的光密度差异,则视为具有表达量的差异。HPLC-CHIP/MS分析:富集柱等度洗脱条件:流动相为0.1% (v/v)甲酸-超纯水溶液,流速:4μL/min;分离柱梯度洗脱条件:流动相A为0.1%(v/v)甲酸-超纯水溶液,流动相B为0.1% (v/v)甲酸-乙腈溶液,起始流动相为3% (v/v)B,保持2min,17min时流动相B为55%(v/v),20 min时B为75%(v/v),保持5min,流速:0.3μL/min。Ultra XCT ion trap Mass Spectrometer以CHIP cube作为离子源,毛细管电压2000 V,干燥气流速0.32 L/min,干燥气温度325℃,质量扫描范围m/z:300～1500 Da。Spectrum Mill MS Proteomics Workbench(Rev A.03.03.078)自动分析MS和MS/MS数据,搜索UniProtKB/SWISS-PORT, Homo Sapiens(Human)数据库。数据库搜索参数设置:Trypsin(胰蛋白酶),Monoisotopic Mass values(单同位素质量),Peptide tol.(母离子质量允差)±2.5 Da,MS/MS tol.(MS/MS质量允差)±0.7 Da,Carbamidometholation(C)修饰。搜索后自动以下列条件进行有效性验证:蛋白评分大于11.0;肽评分大于6.0;SPI(Structure predictability index for protein sequences)大于60%。结果:通过MTT实验,确定在120μmol/L下选择实验浓度都是可行的,最终实验以120μmol/L为阿替洛尔的浓度。通过优化条件,最终确定合适的样品上样量为200μg、染色方法为银染通过对R-ATE和S-ATE作用动脉平滑肌细胞后的二维凝胶电泳图谱进行分析,发现约有6个蛋白斑点表达有差异,对6个差异蛋白斑点进行LC-CHIP-MS/MS分析后,鉴定出了6种可能的差异表达蛋白。结论:本文建立了新的分析阿替洛尔(R),(S)对映异构体作用于VSMC的差异蛋白的双向电泳和多维色谱串联质谱策略。鉴定出的6种差异表达蛋白可能在R-AT与S-AT手性生物学特征的发生机制中起有重要作用。