肝豆状核变性(hepatolenticuler degeneration，HLD)又称Wilson病，是铜代谢障碍导致铜在体内过量沉积所引起的疾病，发病率为1/10万至1/30万，是儿科较常见的遗传代谢病。本病为多系统累及疾病，临床表现多样，所以早期诊断较困难，易致误诊漏诊，导致治疗失败。目前的研究表明基因诊断将是实现早期诊断的较好方法，对HLD基因突变特点的研究将为基因诊断方法的建立确定理论基础。 目前已明确HLD基因定位于13q14.3，cDNA序列长4398bp，含有21个外显子及20个内含子，外显子长度从77bp-1234bp，大多为200bp左右。编码1465个氨基酸。其蛋白产物为一铜转运P型ATP酶。此酶主要有三个功能区：①金属离子结合区(metal binding site domain)，位于N端，有6个与特定金属结合的氨基酸保守序列，长约30个氨基酸左右。②P型ATP酶功能区(也称高度保守区)，包括磷酸酶活性区、磷酸化区，此区含有ATP酶磷酸化底物天冬氨酸残基及ATP结合区。③跨膜区(也称疏水区)，包括6个跨膜螺旋区和1个双亲媒性区，间插于整个多肽链中。 浙江大学博土学位论文 截止目前，己有225种基因突变类型被发现，其中错义、同义或无义突变为144种类型，49种小缺失，12种小插入，3种调节基因突变，l种插入和缺失同时存在的突变，2种复杂重整突变以及门种剪接突变和 3种大片段缺失。国外学者的研究确定 14号外显子 1069密码子为白色人种 HLD患者高频突变点，其突变方式为 HI 069Q．对黄色人种HLD患者的初步研究表明其与白色人种外显子突变特点有明显差异，但目前缺乏对黄色人种患者 HLD基因 ZI个外显子的全面测序筛查，对此基因的突变形式、频度尚未有统一结论。这在理论上很大程度制约了HLD基因诊断方法的建立。 本研究对 HLD基因 ZI个外显子进行全面性测序筛查，探索浙江省汉族患者HLD基因突变数据，为HLD基因诊断方法的建立提供理论论据，为 HLD临床早期诊断作一初朱探索。 第一部分HLD基因外显子突变筛查 目的探索HLD基因外显子突变类型、分布、频度方法从30例浙江省汉族HLD确诊患者外周血中酚氯仿法制备DNA，针对刀个外显子设计引物，PCR扩增各外显子，琼脂糖水平电泳后在 紫外灯下割取目的条带回收PCR产物，Sanger双脱氧链终止法测定 DNA序列。 结果 4 浙江大学博士学位论文一、突变数目：共发现12种突变，其中5种为新突变，7种为己有 报道突变。二、突变类型：单碱基错配11种，小缺失1种。其中错义突变8种， 同义突变2种，调节基因突变2种。三、突变位置卜新发现突变）： exon：＊．123．119delCGCCG exon：－75A＞C exon 2：”287A＞Q D96G exon 2：巧88C＞入D196E exonZ：”1216ThQ 5406A e－con3：＊1366G＞C，V456L exon 8 ：二爿OC＞Q u70L exon 8：2333G＞T R778L exon 10：2495A＞Q K832R exon 2975C＞工＊992L exon：3的SC＞工S门665 exon巫7：3 646G＞A，V1216 MM 四、突变频率：1216 T＞T＞G 26．7％，1366G＞C 23．3％，2310C＞G＊8．3％， 2333G＞T 28．3％，2＊SA＞G 25＊％，2975C＞T 26．7％，其余均为 散发突变，突变率（5％． 结论 一、－123－119dCICGCCG；287A＞Q D96G；588C＞A，D196E；1216T＞Q 5 浙江大学博士学位论文 ＊06A；1366G＞C，＊456L为e D新发现的突变类型。二、浙江省汉族 HLD 患者热点突变区为 121 6T＞Q 5406A； 1366G＞C，V456＊Z 2310C＞Q＊770＊2 2333＊＞T＊778＊2 2495＊＞Q ＊832R；2975C＞丁”92L．而exon 14的3207C＞A，H1069Q未 发现有突变：这与白色人种患者突变规律有很大差异。三、浙江省汉族HLD基因外显于突变以点突变为主，偶见小缺失。 第二部分IILD基因外显子突变型与临床表型关系目的探索eD基因外显子突变与临床表型关系方法收集 3 0例浙江省汉族 HLD确诊患者临床资料（性别；发病年龄；临床分型人 将其与6个突变热点中的5个错义突变位点相比较。结果一、30例患者中，男15例，女15例。发病年龄4～14岁，平均8．96 士 1．87岁。肝型 18例，神经型 8例，其它型 4例。h、5个错义突变位点的突变患者与无突变患者临床表型差异无统计 学意义。结论未发现基因外显子突变类型与临床表型有相关性。