【摘 要】
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在疱疹病毒中,UL15、UL28和UL33基因编码的末端酶直接介导病毒DNA剪切和包装。研究显示,末端酶在胞质中复合形成后经核定位信号（Nuclear localization signal,NLS）引导入核,鸭瘟病毒（Duck plague virus,DPV）UL15蛋白NLS缺失后影响其自身的入核。目前对于DPV末端酶各亚基间相互作用情况及UL15蛋白NLS对末端酶和病毒的影响还尚不清楚。因
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在疱疹病毒中,UL15、UL28和UL33基因编码的末端酶直接介导病毒DNA剪切和包装。研究显示,末端酶在胞质中复合形成后经核定位信号（Nuclear localization signal,NLS）引导入核,鸭瘟病毒（Duck plague virus,DPV）UL15蛋白NLS缺失后影响其自身的入核。目前对于DPV末端酶各亚基间相互作用情况及UL15蛋白NLS对末端酶和病毒的影响还尚不清楚。因此本研究主要对DPV末端酶各亚基间的相互作用情况以及DPV末端酶大亚基UL15蛋白NLS突变对病毒复制的影响进行探讨,以期为DPV基因组剪切和包装奠定分子基础。本文围绕该问题展开研究并获得了以下结果:1.DPV末端酶复合物各亚基间相互作用的鉴定将pcDNA3.1-6His*3-UL15、pCMV-HA*3-UL28和p CMV-myc-UL33质粒转染于DF-1细胞中,间接免疫荧光试验检测到UL15、UL28和UL33蛋白在共表达时,各蛋白在DF-1细胞中存在明显共定位现象,且各蛋白较单独表达时的定位发生明显改变,从主要定位于胞质转变为可完全定位于细胞核内,表明末端酶的形成增强UL15、UL28和UL33蛋白的入核能力。将UL15、UL28和UL33蛋白共表达于HEK293T细胞中,免疫共沉淀试验证实了UL15、UL28和UL33蛋白间存在相互作用,表明UL15、UL28和UL33蛋白通过相互作用形成末端酶复合物。2.DPV UL15蛋白NLS缺失及突变对末端酶各亚基定位及其之间相互作用的影响为明确UL15、UL28和UL33蛋白共表达时定位改变的原因,分别对UL15、UL28和UL33蛋白潜在的NLS进行预测分析,发现三者均无分值较高的NLS,但UL15蛋白在184～196aa处存在一分值较低的NLS。构建UL15蛋白NLS缺失及突变真核表达质粒。当UL15蛋白NLS缺失及突变后,间接免疫荧光试验检测到末端酶亚基UL15、UL28和UL33蛋白的入核能力减弱,其中NLS缺失和187/190位K突变造成的影响最为显著,UL15和UL28蛋白入核的细胞数量下降50%以上。免疫共沉淀结果显示UL15蛋白NLS缺失及突变不影响末端酶复合物形成,表明当UL15蛋白NLS缺失及突变后引起末端酶各亚基蛋白定位改变是由于影响了UL15蛋白NLS的功能,而不是影响了末端酶复合物的形成。为明确UL15蛋白缺失NLS后对末端酶亚基间相互作用的影响,研究发现UL15蛋白NLS缺失后不影响其与UL28蛋白的相互作用,但却影响了其与UL33蛋白的相互作用,表明在末端酶复合物中,UL28蛋白可作为“桥梁”介导UL15和UL33蛋白的间接相互作用。3.DPV UL15蛋白NLS突变对病毒复制的影响为探讨UL15蛋白NLS在病毒复制中的作用,构建UL15蛋白NLS突变株。当187/190位K和188位R突变后,多步生长曲线和噬斑试验发现病毒复制能力减弱,表明UL15蛋白NLS对于病毒复制有着重要作用。双重荧光定量试验发现UL15蛋白NLS突变后,病毒DNA复制不受影响,但病毒基因组剪切呈现明显的抑制,表明UL15蛋白NLS突变对病毒复制产生影响是由于病毒基因组剪切异常造成。
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