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目的:帕金森症(Parkinson’s Disease, PD)是一种慢性进行性的神经退变病,50岁以上人群的发病率为1-2%。a-synuclein蛋白(α-syn)是Lewy小体的主要组成成份,Lewy小体与PD的发病有着重要的关系。细胞中α-syn的过表达会导致线粒体中氧自由基的过量产生以及线粒体结构和功能的异常。但在PD发病的过程中,线粒体神经保护机制尚不清楚。积雪草酸(asiatic acid, AA),是积雪草提取物中的五环三萜烯类组分,具有清除自由基、保护线粒体的作用,可以防治抑郁症,我们以前的研究发现AA具有神经保护作用,但其机制尚不清楚。方法:在鱼藤酮诱导的线粒体轻度损伤模型(模拟PD早期)中,通过Mitotrackerred荧光染料检测线粒体数目,western blot法检测PGC1-α和其调控因子SIRT1的表达,氧电极法检测细胞耗氧量三个方面来检测线粒体的变化。DCFHDA荧光染料检测ROS的生成,试剂盒检测还原型谷胱甘肽含量(Glutathione, GSH)和GSH//氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione, GSSG)。在鱼藤酮诱导的细胞急性和慢性损伤模型中,用MTT法检测细胞存活率,用DCFHDA和JC-1荧光染料分别检测ROS生成和线粒体膜电位,western blot法检测电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel, VDAC)、PGC-1α的表达,化学交联法检测、(?)DAC的寡聚化。接着用MTT法检测AA对急性鱼藤酮损伤的细胞存活率的影响。在鱼藤酮诱导的急性和慢性细胞模型中,我们检测了ROS生成、线粒体膜电位和线粒体数目以评价线粒体功能,western blot法检测VDAC、PGC-1α、细胞色素C(Cytochrome C, Cyto C)和a-syn的表达,化学交联法检测VDAC的寡聚化,以评价AA神经保护作用的线粒体机制。在a-syn过表达的PD果蝇模型中,我们观察了AA对PD果蝇攀爬能力和寿命的影响,用试剂盒检测了AA对PD果蝇体内MDA和GSH的水平的影响,在a-syn诱导的离体小鼠脑线粒体损伤模型上,检测了线粒体功能、Cyto C和a-syn的表达,以分析AA对抗a-syn诱导的神经损伤的线粒体机制。最后我们利用荧光标记和计算机分子模拟AA分析了AA的线粒体定位和直接作用靶点。结果:在鱼藤酮诱导的线粒体轻度损伤模型中,与对照组相比,12.5-25nmol/L鱼藤酮可以显著提高细胞耗氧量、GSH含量和GSH/GSSG比值及PGC-1a,但是高于25nmol/L时,鱼藤酮对细胞功能的影响不大。同时,12.5-100nmol/L鱼藤酮能够剂量依赖性增加细胞内线粒体数目、ROS生成和SIRT1表达,表明在ROS的作用下,低浓度鱼藤酮能够刺激线粒体兴奋性作用。在鱼藤酮诱导的线粒体急性或慢性损伤模型中,鱼藤酮下调了VDAC表达,诱导其发生寡聚化,从而破坏线粒体膜通透性,损伤了线粒体功能,诱导细胞发生凋亡。另一方面,0.01-100nmol/L AA能够治疗100nmol/L鱼藤酮诱导的PD样细胞损伤。在鱼藤酮损伤的细胞中,加入AA,能够对抗线粒体膜电位去极化和ROS的上升,抑制BAX的上调,对抗VDAC表达的降低和二聚体的形成。在5nmol/L鱼藤酮诱导的细胞慢性损伤模型上,AA能够保护线粒体,阻止a-syn过表达和线粒体转位,对抗Cyto C的释放。在PD果蝇模型中,0.5-2mg AA/100g培养基能够显著提高果蝇攀爬能力,延长其寿命,PD果蝇体内MDA含量明显下降,GSH含量显著上升,这可能与AA抗氧化能力有关。在离体线粒体模型上,我们观察到AA能够逆转α-syn引起的线粒体膜电位的下降,稳定膜完整性和ATP的合成,抑制ROS的生成,避免细胞凋亡。AA的保护作用与其阻止α-syn线粒体转位有关。最后我们还发现AA可以直接定位于线粒体中,其靶点可能为VDAC。结论:PD发病之前,线粒体轻度损伤,ROS适量生成,刺激了线粒体兴奋性,但是如果线粒体急性或持续轻度损伤,反而导致ROS过量生成,线粒体功能受损,VDAC二聚化和表达降低,线粒体膜通透性改变,凋亡因子释放到细胞中,启动凋亡。另一方面,AA对抗线粒体缺陷引起的细胞损伤,发挥神经保护作用的机制可能为抑制VDAC二聚体的形成,维持线粒体膜完整性,从而阻止了a-syn的线粒体转位,避免了线粒体功能下调和Cyto C等凋亡诱导因子的释放,最终保护细胞,对抗PD发病过程中神经元的凋亡。我们的结果提示线粒体在PD发病过程中具有重要作用,以线粒体为靶向的药物AA可能可以作为防治PD的候选药物进行研发。