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本研究针对蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali Chen et Dai)发酵液多糖的活性和活性较高多糖组分的结构开展了一系列的实验研究,主要内容包括蝙蝠蛾拟青霉发酵液多糖的分级醇沉、不同分级醇沉粗多糖组分对果蝇寿命和果蝇体内SOD活力及MDA含量的影响,并从中选择活性最高的粗多糖进行进一步的研究。对活性最高的多糖组分进行了免疫调节活性、对佐剂性关节炎大鼠和失血性贫血小鼠的作用等方面的研究;然后用DE-52纤维素离子交换层析柱和Saphedax G-150交联葡聚糖凝胶层析柱对该粗多糖组分进行了分离纯化;之后,对分离纯化的多糖组分的抗肿瘤活性及结构分别进行了研究和分析。将蝙蝠蛾拟青霉发酵得到的发酵醪经16000rpm离心10min,除去菌丝;发酵液在45℃条件下真空旋转浓缩至原体积的1/4,分别依次加入乙醇使乙醇的终浓度为20%、30%、40%、50%、60%和70%分级沉淀得到粗多糖。将乙醇终浓度为20%、30%、40%、50%、60%和70%时,醇沉得到的蝙蝠蛾拟青霉胞外粗多糖组分分别标记为P20、P30、P40、P50、P60、P70,其得率分别为:0.13、0.08、0.06、0.78、0.45和0.18mg/mL。将不同乙醇浓度沉淀得到的粗多糖按1%(W/V)剂量分别添加到果蝇的饲料中,以不添加多糖组作为对照组(CK),进行饲养。实验结果表明粗多糖P60延缓衰老作用最好,对雌雄果蝇的半数死亡时间、平均寿命和平均最高寿命的延长率分别是6.47%、15.83%,17.04%、18.36%,28.81%和17.87%。P50和P60,可显著提高果蝇体内的SOD活性,并降低MDA含量,且P60作用效果较好。P60对雌雄果蝇体内SOD活力分别提高28.02%和26.85%,MDA含量分别降低50.67%和54.30%。表明蝙蝠蛾拟青霉胞外粗多糖P60具有良好的抗氧化和延缓衰老作用,将其选择作为进一步研究的对象。粗多糖P60的免疫调节实验结果表明:300mg/kg的蝙蝠蛾拟青霉胞外粗多糖P60能明显促进正常小鼠胸腺指数和脾脏指数的增长,增强小鼠的免疫功能。300mg/kg和450mg/kg均能提高免疫抑制的小鼠的免疫功能,也能抑制小鼠迟发型超敏反应;300mg/kg蝙蝠蛾拟青霉粗多糖P60能促进小鼠巨噬细胞增生,激活吞噬活性,增强小鼠吞噬异物能力。佐剂性关节炎大鼠模型实验结果表明:蝙蝠蛾拟青霉胞外粗多糖P60能抑制佐剂性关节炎大鼠左足趾继发性肿胀的程度,并对佐剂性关节炎大鼠血清内TGF-β1、TNF-α产生有一定的作用:促进佐剂性关节炎大鼠血清内TGF-β1的浓度升高,对佐剂性关节炎大鼠血清中促炎性细胞因子TNF-α的产生有一定的抑制作用;而对于IL-1β的产生无明显的影响作用。表明蝙蝠蛾拟青霉胞外粗多糖P60对佐剂性关节炎有一定的治疗作用。失血性贫血小鼠实验结果显示:用蝙蝠蛾拟青霉胞外粗多糖P60对失血性贫血小鼠进行灌胃28天后,低剂量组和高剂量组失血性贫血小鼠的外周血血红蛋白含量恢复正常,同时,外周血红细胞数也恢复至正常小鼠水平;并且有利于单核细胞和中性粒细胞恢复至正常小鼠水平;但是对小鼠血小板数和白细胞总数无明显的影响。粗多糖P60经Saveg试剂除蛋白,然后用DE-52纤维素离子交换层析柱进行初步纯化得到4个组分:PS1、PS2、PS3和PS4;将4个组分分别再经Sephadex G-150交联葡聚糖凝胶层析柱进行进一步的分离纯化,PS1和PS3仍是单一峰,PS2和PS4分别分离出2个组分:PS2-1、PS2-2和PS4-1、PS4-2。6个样品经Sephadex G-150交联葡聚糖凝胶层析检测和紫外200-400nm扫描初步判定均为均一性多糖。将粗多糖P60和分离纯化得到的纯化多糖组分分别进行对肺癌细胞A549、黑色素瘤细胞B-16、鼻咽癌细胞CNE和肝癌细胞HepG2增殖的抑制实验。实验结果表明:处理24h后,0.05μg/mL的粗多糖P60对A549细胞增殖的抑制作用较好,抑制率达到37.37%;浓度为5μg/mL多糖PS4-1对B-16细胞增殖的抑制作用达到32.54%;浓度为500μg/mL多糖PS3对CNE细胞增殖抑制作用较好,抑制率达到28.93%;浓度为50μg/mL多糖PS4-1对HepG2细胞增殖的抑制作用最好达到29.51%。处理48h后,0.05μg/mL粗多糖P60对A549细胞增殖的抑制作用较好,抑制率达到42.00%;浓度为5μg/mL多糖PS3对B-16细胞增殖的抑制作用最佳,抑制率达到47.15%;浓度为500μg/mL多糖PS3对CNE细胞增殖的抑制作用较好达到37.06%;浓度为500μg/mL多糖PS4-1对HepG2细胞增殖的抑制作用最高,抑制率达到42.51%。处理72h后,浓度为0.05μg/mL的粗多糖P60对A549抑制作用最佳,抑制率达到49.64%;浓度为5μg/mL多糖PS3对B-16细胞增殖的抑制作用达到52.81%;浓度为500μg/mL多糖PS4-1对CNE的抑制作用较好,抑制率达到59.84%;浓度为50μg/mL多糖PS3对HepG2细胞增殖的抑制作用达到56.17%。通过对多糖样品的FTIR、GC-MS、1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、HSQC和HMBC等分析,分别初步推测6个多糖样品的可能结构如下:PS1的分子量为361kDa,由葡萄糖、半乳糖和甘露糖组成,三者的摩尔比为5.15:0.30:0.10,其可能结构是以-1,6-D-Glcp连接形成主链,在-1,6-D-Glcp的3位处产生支链,与-1,3-D-Galp和β-1,3-D-Manp相连,端基由Glcp、Galp和Manp组成。其主链结构如下:→6)-α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→PS2-1的分子量为412kDa,由半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖和甘露糖组成,单糖的摩尔比为:3.98:1.00:0.28:0.33:0.18;其可能结构为以β-1,4-D-Galp连接形成主链,在β-1,4-D-Galp的3位处产生支链,与-1,3-D-Alap相连形成重复单位,含有少量的Xyl、Man和Glc残基。根据上述结果,PS2-1可能存在如下重复单元:PS2-2的分子量为48kDa,由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,三者的摩尔比为:0.14:5.10:0.32;其可能结构为以-1,6-D-Glcp连接形成主链,在-1,6-D-Glcp的3位处产生支链,与-1,3-D-Galp和β-1,3-D-Manp相连,端基由Glcp、Galp和Manp组成。其主链结构如下:→6)-α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→PS3的分子量为536kDa,由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖组成,四者的摩尔比为:0.62:0.34:0.13:4.62;其可能结构是以半乳糖残基通过β-1,4-糖苷键连接形成主链结构,葡萄糖残基通过β-1,3-糖苷键连接到半乳糖的C3上,部分阿拉伯糖残基或木糖残基通过α-1,3-糖苷键连接至葡萄糖残基的C3;其余阿拉伯糖残基或木糖残基通过β-1,3-糖苷键连接到半乳糖主链上。其主链结构式如下:→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→PS4-1的分子量为729kDa,由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成,三者的摩尔比为1.13:0.21:4.40;其可能结构是半乳糖残基通过β-1,4-糖苷键连接形成主链结构,阿拉伯糖残基和葡萄糖残基通过β-1,3-糖苷键连接到半乳糖主链上,每4个半乳糖残基连接1个阿拉伯糖残基。每5个上述半乳糖残基和阿拉伯糖残基的重复单元通过β-1,3-糖苷键连接1个葡萄糖残基。即每5个通过β-1-3糖苷键连接1个D-Glcp残基。PS4-2的分子量为668kDa,由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成,三者的摩尔比为:0.62:0.57:4.46;其可能的结构是半乳糖残基通过β-1,4-糖苷键连接形成主链结构,阿拉伯和葡萄糖残基糖残基通过β-1,3-糖苷键连接到半乳糖主链上,约每15个半乳糖残基连接2个阿拉伯糖残基和2个葡萄糖残基。其可能的主要结构式如下: