【摘 要】
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二噁英类化合物是一类持久性有机污染物,能结合芳香烃受体(AhR)并诱导毒性效应,细胞色素P450 1A1(CYP1A1)的表达水平是AhR信号通路激活的典型生物标志物。工业生产和生活产生各种各样的二噁英类污染物,在全球化学循环中迁移并广泛分布于海洋。检测海水二噁英类污染物的传统方法需要复杂的前处理、耗时长、成本高。本研究运用分子克隆技术,对比不同物种的cyp1a1启动子的活性、对比不同数量的二噁英
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二噁英类化合物是一类持久性有机污染物,能结合芳香烃受体(AhR)并诱导毒性效应,细胞色素P450 1A1(CYP1A1)的表达水平是AhR信号通路激活的典型生物标志物。工业生产和生活产生各种各样的二噁英类污染物,在全球化学循环中迁移并广泛分布于海洋。检测海水二噁英类污染物的传统方法需要复杂的前处理、耗时长、成本高。本研究运用分子克隆技术,对比不同物种的cyp1a1启动子的活性、对比不同数量的二噁英反应元件(DRE)的斑马鱼cyp1a1启动子的活性,筛选高检测灵敏度的荧光素酶报告质粒,构建稳定转染细胞系应用于AhR激动剂类农药的筛查。结果表明,含有12个DRE斑马鱼cyp1a1启动子的检测灵敏度高于野生型黑点青鳉cyp1a1启动子、已报道的高灵敏度小鼠cyp1a1启动子。运用Tol2转座子转基因技术,成功构建用于检测海水中AhR激动剂的Tg(cyp1a-12DRE:egfp)转基因黑点青鳉。该转基因黑点青鳉的检测灵敏度高、特异性高、荧光背景低,成功应用于中国福建泉港的大量二噁英类化合物污染海区海水的直接检测。建立了海水富集浓缩再稀释的方法,适用于检测二噁英类污染物的浓度低于转基因黑点青鳉灵敏度的实际海水,有效提高了方法检测限。大连湾、锦州湾海水提取物的转基因黑点青鳉荧光检测法和化学仪器检测法的结果相关性较大,说明转基因黑点青鳉Tg(cyp1a-12DRE:egfp)检测实际海水二噁英类污染物的准确度高。转基因黑点青鳉Tg(cyp1a-12DRE:egfp)用于海水AhR激动剂类农药的筛查,发现草不隆、甲萘威、嘧菌胺、敌草隆具有AhR激动剂活性,进一步发现敌草隆的代谢产物DCPMU、DCPU具有AhR激动剂活性。环境浓度敌草隆长期暴露黑点青鳉的焦虑样反应增加、攻击性减小、避敌行为增加、集群行为减少、学习记忆能力降低、生殖行为异常。黑点青鳉的脑多巴胺含量减少可能是部分行为异常的原因。环境浓度敌草隆暴露180天的黑点青鳉雄鱼的性体指数减小、精巢的发育和成熟受到抑制、精子活力降低。肝脏的AhR信号通路激活代谢酶基因cyp1a1、cyp1b1、ugt1、ugt2表达水平升高,催化敌草隆大量转化为DCPMU和DCPU。下丘脑-垂体-性腺-肝轴的相关基因表达异常,体内GnRH、FSH、LH含量升高。敌草隆暴露黑点青鳉雄鱼的F1代胚胎的存活率降低,仔鱼的畸形率升高。环境浓度敌草隆长期暴露180天的黑点青鳉雌鱼的性体指数减小、卵巢的发育和成熟受到抑制。肝脏的AhR信号通路激活代谢酶基因cyp1a1、cyp1b1、ugt1、sult1表达水平升高,催化敌草隆大量转化为DCPMU和DCPU。下丘脑-垂体-性腺-肝轴的相关基因表达异常,体内GnRH、LH、E2含量降低、雌二醇与睾酮的比值减小。敌草隆暴露黑点青鳉雌鱼的F1代仔鱼的畸形率升高。转基因黑点青鳉灵敏、特异、廉价快速、便捷直观的高效检测方式,为评估海洋二噁英类污染的生态毒性风险提供新思路。环境浓度敌草隆暴露黑点青鳉的研究揭示了 AhR信号通路激活代谢酶表达,催化敌草隆大量转化为代谢产物诱导毒性效应的机制。有助于理解敌草隆乃至AhR激动剂类农药对海洋鱼类健康的长期影响,对于海洋环境、鱼类资源的保护具有重要意义。
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