论文部分内容阅读
目的:探讨姜黄素(curcumin)对人肾癌细胞786-O生长的体外作用及其相关机制,同时观察姜黄素联合索拉非尼(sorafenib,BAY 43-9006,Nexavar)对人肾癌细胞786-O的体外作用。方法:实验细胞分为4组:空白对照组、索拉非尼单药组、姜黄素单药组、姜黄素联合索拉非尼组。索拉非尼和姜黄素单独或联合作用于细胞,以四甲基偶氮唑蓝(terzolium-based colorimetric assay,MTT)比色法检测24h、48h、72h时间点药物对786-O细胞的增殖抑制率,测定吸光度OD值。流式细胞仪测定姜黄素对786-O细胞周期分布和凋亡的影响,光学显微镜,观察细胞形态学改变,电子显微镜下观察细胞超微结构变化,免疫组化法检测姜黄素对人肾癌786-O细胞内Survivin、NF-KB、Caspase-3蛋白表达水平的影响。结果:1.姜黄素、索拉非尼两单药对人肾癌细胞786-O增殖的抑制作用。MTT比色法显示姜黄素、索拉非尼两单药对人肾癌786-O细胞的生长均有明显的抑制作用。不同浓度姜黄素、索拉非尼处理24～72h后,与对照组相比,各处理组OD值均有不同程度下降,差异有显著性(P<0.05)。各处理组间比较,亦具有显著性差异(P<0.05)。且随药物处理浓度的增大、作用时间的延长,OD值逐渐下降,即姜黄素、索拉非尼对786-O细胞的增殖抑制作用有明显的剂量-效应和时间-效应依赖关系。姜黄素处理24h、48h、72h,IC50分别为38.7μmol/L、29.2μmol/L、21.8μmol/L,索拉非尼处理24h、48h、72h,IC50分别为7.7μmol/L、6.5μmol/L、5.1μmol/L。2.MTT比色法分析姜黄素联合索拉非尼对786-O细胞的增殖抑制作用。姜黄素12.5μmol/L、25μmol/L分别与索拉非尼1.5μmol/L、3μmol/L、6μmol/L、12μmol/L联合24h、48h、72h后的抑制率显著高于单用索拉非尼、姜黄素组(P<0.05),两者呈现出相加的抗瘤效果。单用索拉非尼的IC50为7.7-5.1μmol/L,联合12.5μmol/L姜黄素后可将索拉非尼的IC50降低至5.02-2.36μmol/L;联合25μmol/L姜黄素后可将索拉非尼的IC50降低至2.53-1.38μmol/L。因此,我们得出结论:在一定浓度范围内,姜黄素可加强索拉非尼对786-O细胞的增殖抑制作用。3.光镜下,姜黄素25μmol/L作用786-O细胞48h后,有明显的细胞形态学改变:即细胞缩小、变圆。随姜黄素浓度的增大和作用时间延长,细胞开始破裂,有的细胞胞浆中出现空泡,有的培养液中可见到大量细胞碎片。在透射电镜观察可见胞核局部向外呈锐角突起,核染色质高度浓缩,电子密度增高,边集于核膜下,形成沿核膜收缩的新月状体。4.流式细胞仪检测786-O细胞周期分布和凋亡显示,12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L姜黄素作用786-O细胞48h后,随药物浓度的增大,G0/G1期细胞逐渐增多;S期和G2/M期细胞则逐渐减少。即姜黄素可阻滞786-O细胞周期进程于G1期,该作用呈剂量-效应依赖关系。12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L姜黄素作用786-O细胞48h后,均出现典型的亚二倍体凋亡峰,依姜黄素浓度增大而逐渐升高;凋亡百分率分别为: 12.19%、22.12%、33.40%,与对照组相比差异具有显著性统计学意义(P<0.05)。5.免疫组化结果显示:姜黄素25μmol/L作用786-O细胞48h,Survivin、NF-KB的蛋白表达均减弱,Caspase-3的蛋白表达增强,与对照组相比差异具有显著性(P<0.05)。结论:1.本研究首次通过体外实验证实了多靶向的天然药物姜黄素具有明显的抗肾癌细胞786-O的作用,为肾癌的治疗提供了新的理论基础。2.本实验证实索拉非尼与姜黄素均具有明显的抑制人肾癌细胞786-O的作用,且此作用均呈明显时间-剂量依赖关系。3.本实验证实姜黄素可协同索拉非尼对人肾癌786-O细胞的增殖抑制作用。4.本实验证实姜黄素可阻滞人肾癌细胞786-O于G1期并可诱导该细胞凋亡。5.我们初步推论姜黄素通过上调Caspase-3蛋白的表达,下调Survivin、NF-KB蛋白的表达,发挥其抑制人肾癌细胞786-O增殖、诱导该细胞凋亡的作用。6.本实验证实了姜黄素这一天然多靶向的药物具有抑制肾癌细胞增殖的作用,并通过姜黄素联合索拉非尼的研究丰富了肾癌的治疗。