盐胁迫对菊芋果聚糖代谢的影响及其分子调控的初步研究

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本论文以菊芋品种南芋一号(NY-1)和青芋二号(QY-2)为试材,在温室进行土培盆栽试验,研究了两个菊芋品种在不同盐处理下的生长和生理表现,在此基础上选取合适的盐处理浓度进行了全生育期试验,研究了盐胁迫对菊芋干物质和糖分积累分配的影响;与此同时,从菊芋中分离克隆了果聚糖外切水解酶基因,并通过巴斯德毕赤酵母表达系统初步验证了该基因的功能;并进一步研究了盐胁迫下菊芋果聚糖代谢的相关基因对盐处理的响应行为。主要研究结果如下:1.较低的土壤盐分(1g·kg"1)对菊芋的生长影响不显著,土壤盐分达2g·kg"1以上时,菊芋生长明显受到抑制、叶绿素含量和光合速率下降、叶片中可溶性糖含量增加。NY-1在盐胁迫下的茎粗较大,生长表现为“矮壮”,株高相对生长速率和生物量降幅较小,在茎、叶中积累了较多的可溶性糖而有较多的干物质积累。QY-2在盐胁迫下植株较高,生长表现为“高瘦”,通过维持较高的叶绿素含量和光合速率来应对盐胁迫。土壤盐分为2g·kg-1时,NY-1和QY-2的生物量分别比对照减少了48.39%和59.05%;土壤盐分为3g-kg-1时,其生物量降幅分别为65.8%和72.1%。2.盐胁迫导致菊芋块茎的单株产量降低,NY-1和QY-2块茎干重降幅分别为57.78%和85.61%,块茎产量的降低是由两方面原因引起的:一是地上部干物质来源减少和转运速率降低,二是块茎干物质积累速率降低。盐胁迫改变了菊芋干物质的分配格局,地上部分配比例增大而块茎分配比例减小,盐胁迫对块茎的限制作用比地上部更大。盐处理下块茎干物质积累量和积累速率的降幅都为NY-1<QY-2。3.块茎发育过程中,持续的盐处理降低了菊芋茎中的总可溶性糖含量,茎中还原糖含量下降幅度较大,但茎中的非还原性糖含量却有所增加,非还原糖含量的增加可能是盐胁迫下渗透调节的一种表现,但不利于茎中的糖分向地下块茎转运。盐处理使块茎发育前期(90~130d)的果聚糖含量上升,但降低了块茎发育中、后期(130~210d)的果聚糖含量,盐胁迫诱导块茎糖分合成积累提前,但不利于块茎中糖分的持续有效积累。盐胁迫对菊芋块茎中果聚糖积累的限制作用极其显著,对QY-2的限制作用尤为突出,QY-2块茎果聚糖积累量和积累速率的下降幅度都大于NY-1。4.果聚糖代谢关键酶基因(1-SST、1-FFT和1-FEH)的半定量RT-PCR表达分析表明,盐胁迫使1-SST和1-FFT在块茎发育前期(90~130d)的表达量上升,诱导块茎中果聚糖的合成提前,但降低了块茎发育中、后期(130~210d)1-SST和1-FFT的表达量,不利于果聚糖的持续积累。在地上部快速生长期(50d),盐胁迫诱导1-FEH在叶片中的表达量上升,并伴随着叶片中还原糖含量的上升,1-FEH在叶片中的转录正调控可能有利于菊芋在盐胁迫下的生理防卫。5.利用其它物种已有的1-FEH编码序列到菊芋和向日葵的EST数据库中进行比对分析,通过EST序列的筛选和拼接,获得了一条包含ORF全长的EST序列并设计特异引物,从菊芋中克隆到了一个可能的1-FEH基因,该基因的CDS全长为1683bp,编码560个氨基酸,预测蛋白大小为62.7kDa,等电点为6.24。同源序列比对发现,该基因具有糖苷水解酶32家族的三个保守基序NDPN、RDP和EC;与向日葵细胞壁转化酶基因cwINV1有最高的同源性,其氨基酸序列相似性达96%,但向日葵的cwINV1基因功能尚未得到验证;与功能已明确的菊苣1-FEHI氨基酸序列相似性达75%。基因表达模式分析表明,Ht1-FEH主要在发芽的块茎中表达,可能参与菊芋块茎萌发过程中果聚糖降解代谢的转录调控。6.菊芋1-FEH在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastor is X33)中成功分泌表达,重组蛋白的分子量大小在100kDa左右,大于软件预测的分子量,重组蛋白的糖基化修饰可能是使其分子量变大的原因。重组蛋白具有果聚糖水解酶活性,而对蔗糖没有水解活性,初步验证了Ht1-FEH确实为果聚糖外切水解酶基因。
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