帕金森病(PD)是一种锥体外系疾病，主要病理改变为中脑黑质多巴胺神经元进行性变性和坏死。由于患者的黑质纹状体通路受损，导致黑质转运到纹状体的多巴胺含量减少，从而引起静止性震颤、肌强直和运动障碍等临床症侯群。目前神经干细胞和胎脑组织的移植被认为是可能有潜在应用价值的手段，但由于存在伦理问题和免疫排斥等问题，限制了它们在临床上的应用。因此，最理想的移植是移植物既能保持一定的数量和长期在体内存活，而且能产生多巴胺和分泌各种营养因子，从而改善移植区的营养状况和阻止PD进行性恶化，达到治愈PD的目的。本研究首先从体外探讨了骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cell，MSCs)神经分化的可能性，研究了MSCs对MPP~+损伤的离体脑片的保护作用及其机理。在此基础上，将MSCs移植至PD模型鼠脑内，应用MR成像技术在体观察了移植的MSCs在脑内分布和迁徙情况，探讨了MSCs移植治疗PD的效果，为MSCs移植治疗PD提供了有价值的实验依据。 第一部分 体外不同培养条件对骨髓间充质干细胞神经分化的影响 目的：探讨不同条件培养的MSCs能否在体外向神经细胞分化的可能性。 方法：取成年大鼠骨髓，培养、分离和纯化骨髓间充质干细胞。将培养的第4代MSCs随机分为五组，其中三组分别置于DMEM+FBS、干细胞培养基和神经元培养基，另两组分别与神经元联合培养和离体纹状体脑片共培养。相差显微镜观察MSCs的形态学改变，用免疫荧光组化技术对分化后的细胞进行鉴定，用RT-PCR检测不同条件培养的MSCs部分标志基因的表达。 结果：MSCs与神经元联合培养14天，大部分MSCs的细胞形态并未发生明显的改变，细胞呈长扁平状。少量的MSCs形态呈强折光的锥形或圆形胞体以及有长的多极突起，免疫荧光显示它们明显地表达了MAP—2和GFAP；MSCs与离体脑片共培养14天，部分MSCs细胞核变大并生成突起，有很强的Nestin表达；用不同培养基培养的其他三组MSCs未发生明显的变化。RT—PCR结果表明，不同培养条件培养的MSCs，其Nestin、GFAP和MAP-2的基因表达亦无明显变化。结论：MSCs与神经元联合培养或MSCs与脑片之间的接触是MSCs向神经细胞分化的重要条件。 第二部分 骨髓间充质干细胞对离体大鼠纹状体—黑质脑片的作用 目的：探讨骨髓间充质干细胞对MPP~+损伤的离体黑质—纹状体脑片多巴胺能神经元的保护作用以及对单胺类神经递质的影响。 方法：建立MPP~+损伤的离体脑片模型。取成年大鼠骨髓，培养、分离和纯化骨髓间充质干细胞。将骨髓间充质干细胞与离体脑片联合培养，通过免疫组化和电镜等方法观察骨髓间充质干细胞对联合培养的MPP~+损伤脑片的保护作用。用高效液相色谱分析脑片和培液中多巴胺及其代谢产物3，4—二羟苯乙酸和高香草酸水平的变化。 结果：MPP~+可造成离体黑质—纹状体脑片的细胞大量死亡，但与MSCs联合培养7天，脑片周围神经轴突生长增多，脑片中的细胞死亡减少、超微结构损伤减轻、表达TH的阳性细胞数目增多(p＜0.05)。MPP+损伤的脑片组织中的多巴胺含量与正常组和联合培养组相比明显减少(p＜0.01)，前者培液中的3，4—二羟苯乙酸和高香草酸水平也显著减少(p＜0.05)，但联合培养组与正常组相比上述物质无显著差异。 结论：MSCs在体外能促进受损的黑质多巴胺能神经元存活，可望用于帕金森病的移植治疗。 第三部分 超顺磁氧化铁标记骨髓间充质干细胞移植治疗帕金森模型鼠的实验研究 目的：观察移植的MSCs在PD模型鼠脑内的迁移及分化，探讨MSCs移植治疗PD的可能性。研究应用超顺磁氧化铁(SPIO)和BrdU标记骨髓间充质干细胞(MSCs)移植治疗帕金森病(PD)大鼠的活体MRI观察及组织学观察。 方法：分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞，一组MSCs用脂质体转染法进行SPIO标记，另一组MSCs用BrdU标记；制作PD大鼠模型，将不同标记的MSCs分别移植到PD大鼠右侧纹状体区，利用阿朴吗啡观察PD鼠的行为学变化，采用MRI在体观察脑内移植的MSCs存活和迁徙情况。应用透射电镜和免疫荧光双标法观察移植后的MSCs增殖和分化。 结果：体外SPIO标记的骨髓间充质干细胞为普鲁氏蓝染色阳性；对移植了SPIO标记MSCs的PD大鼠行磁共振检查，T2和T2 GRE扫描在移植区呈低信号改变，随时间的延长，移植区信号向周围扩大，但信号减弱。普鲁氏蓝染色显示脑纹状体区SPIO标记的MSCs从移植部位向四周迁移。电镜显示，SPIO标记的MSCs呈类神经元形态。免疫荧光组化结果表明，MSCs移植后4周，在移植区可见少量BrdU和nestin标为阳性的神经前体细胞，12周时可见少量双标的神经细胞，未发现明显的BrdU和TH双标为阳性的细胞。移植组与对照组相比行为学(旋转次数)有明显差异(19＜0.05)。 结论：SPIO可用于体外标记MSCs，通过MRI技术可以对脑内移植的SPIO标记MSCs进行活体示踪，MSCs移植治疗能明显改善PD鼠的行为学。