匹马霉素是一种重要的抗真菌多烯类抗生素,被广泛用作食品防腐剂、抗真菌兽药以及用于人类角膜炎治疗。多烯类抗生素可以与真菌细胞膜内麦角甾醇或哺乳动物细胞膜内胆固醇结合,在具有优良抗真菌活性的同时,还具有较为严重的溶血毒性。匹马霉素的临床应用则被其溶血毒性及相对偏低的抗真菌活性所限制。因此,高效低毒匹马霉素衍生物的创制迫在眉睫。通过失活恰塔努加链霉菌Streptomyces chattanoogensis L10中匹马霉素生物合成基因簇内的P450单加氧酶基因scnG,我们成功发现并鉴定了三种新型匹马霉素衍生物:12-脱羧-12-甲基匹马霉素(衍生物1)、4,5-去环氧-12-脱羧-12-甲基匹马霉素(衍生物2)及2-氢-3-羟基-4,5-去环氧-12-脱羧-12-甲基匹马霉素(衍生物3)。体外实验表明,P450单加氧酶ScnD能够催化衍生物2发生C4-C5位环氧化产生衍生物1,这暗示scnG失活突变株中衍生物2的积累可能是由ScnD催化效率较低造成的。此外,匹马霉素聚酮合酶DH12结构域失活能够导致衍生物3的特异性积累,暗示基因scnG失活降低了DH12结构域的催化活性,从而导致衍生物3的产生。P450单加氧酶ScnG体外生化分析同样表明,ScnG无法催化匹马霉素糖苷配体4或5发生环外羧基化,这进一步暗示了ScnG催化的环外羧基化发生在聚酮链延伸过程中,而不是普遍认为的匹马霉素PKS后修饰第一步。体外抗真菌活性及溶血毒性测定实验发现,衍生物1的生物活性较匹马霉素明显提高,其抗真菌活性约为匹马霉素的2倍,而溶血毒性较匹马霉素降低了4.5倍,是一种具有良好应用前景的高效低毒抗真菌候选药物。衍生物2的抗真菌活性虽仅为匹马霉素的50%,但其溶血毒性大幅降低,是一种安全抗真菌候选药物。衍生物3则没有明显活性与毒性,是scnG失活突变株中的无活性副产物。副产物3的产生使低毒衍生物1与2的分离纯化过程变得复杂,限制了其大量生产,因此,我们尝试通过基因工程改造来消除scnG失活突变株中副产物3的产生。由于副产物3的产生可能是由DH12结构域的不完全催化造成的,可以尝试通过提高DH12结构域的催化活性来降低或消除副产物3的产生。我们首先尝试了DH12结构域所在的PKS基因scnS4的过表达以及将DH12结构域替换为DH11结构域,但均未对产物组成造成明显影响。而以DH11-KR11双结构域替换DH12-KR12双结构域时,则完全消除了副产物3的产生,并大大提高了衍生物1与2的产量。此外,本论文还研究了DH-KR双结构两侧linker区域对结构域替换效果的影响,发现受体linker区域的保留更有利于杂合PKS的高效催化。在DH12-KR12双结构域替换的基础上,通过P450单加氧酶基因scnD缺失,构建了定向积累衍生物2的高产菌株(805±32mg/L);通过基因scnD及其辅助基因scnF的过表达,则实现了衍生物1的定向高产(746±35 mg/L)。在定向高产衍生物1或2菌株的基础上,我们尝试通过理性改造匹马霉素TE结构域,进一步提高匹马霉素衍生物的产量。以TE结构域同源建模结果为指导,通过TE结构域定点突变,成功改变了TE结构域的催化特性,并获得了线性的匹马霉素聚酮链中间体6。此外,我们还以中间体6的SNAC衍生物7为底物,成功构建了匹马霉素TE结构域的体外生化分析体系,为基于TE结构域理性改造的低毒匹马霉素衍生物高产奠定了基础。本研究首次报道了通过基因工程改造获得低毒匹马霉素脱羧-甲基衍生物的相关工作,并对衍生物的生物合成机制进行了解析。同时,本研究还首次报道了通过PKS双结构域替换及PKS后修饰基因改造,同时实现了副产物的消除及目标产物的定向高产,为匹马霉素衍生物1或2的产业化及临床应用奠定了基础,也为其他相关研究工作提供了借鉴。