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研究背景和目的皮肤恶性黑素瘤（cutaneous malignant melanoma，CMM）是一类恶性程度极高的皮肤肿瘤，其发病率和死亡率有逐渐上升趋势。近3年经我院确诊的黑素瘤相关病例也明显增多，随访发现患者不仅预后差，生存期也较其他皮肤肿瘤明显缩短，严重危害人类生命。皮肤恶性黑素瘤细胞极具早期侵袭和转移特性，且与肿瘤转归差密切相关。肿瘤侵袭转移过程中有诸多因素和环节参与，如：机体免疫细胞、细胞信号转导途径、肿瘤微环境中各种细胞因子等。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是指浸润于肿瘤间质中的巨噬细胞，与肿瘤的发生、发展关系密切，是多数实体肿瘤组织中数量最多的炎症细胞群。然而，TAMs在肿瘤侵袭进展中的作用及机制目前尚存争议。不同研究提示，TAMs可能兼有促进或抑制肿瘤细胞生长的双重作用。TAMs在肿瘤中进展中的作用可能受其分布、数量和表型三方面的影响，其中表型差异可能是影响肿瘤细胞侵袭转移的关键因素。研究者根据巨噬细胞激活途径及激活后作用的不同将其分为两类：经干扰素-γ（Interferon-γ，INF-γ）及细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等激活的巨噬细胞称为经典激活的巨噬细胞（classical activated macrophage， caMφ或M1），为一类“抑癌细胞”；经白介素-4（interleukin-4，IL-4），白介素-13（interleukin-13，IL-13）等激活的巨噬细胞称为替代激活的巨噬细胞（alternative activated macrophage，aaMφ或M2），为一类“促癌细胞”。TAMs在黑素瘤细胞侵袭进展中的作用和影响机制目前尚不明确，值得进一步研究。近年来随着对肿瘤细胞间信号通路在肿瘤发生发展中的影响有了更多了解，人们发现信号转导和转录活化因子3（Signaltransducer and activator of transcription，STAT3）是STATs家族的重要成员，是多种致癌途径的焦点，参与调控相关靶基因的表达，其中就包括了血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）。有研究表明VEGF是最重要的血管生成因子,可直接由STAT3信号通路调控，促进肿瘤新生血管的生成，是导致肿瘤细胞远处侵袭转移的重要因素之一。TAMs对恶性黑素瘤的发生和发展具有重要作用，TAMs是否通过调节恶性黑素瘤中蛋白如STAT3、VEGF的表达，对恶性黑素瘤细胞的各种生物学行为造成影响，值得我们进一步探究。在本实验中，我们主要采用佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）在体外成功诱导成巨噬细胞，流式细胞仪检测CD68的表达；随后分别用LPS、IL-4刺激成M1型和M2型巨噬细胞，ELISA法检测IL-12p70和IL-10表达水平；建立巨噬细胞与恶性黑素瘤A375细胞体外共培养体系，分别运用MTT法、Transwell小室法观察不同激活途径的巨噬细胞对A375细胞增殖、侵袭、迁移等生物学行为的影响；采用免疫组化法检测CMM组织中CD68（标记TAMs）及VEGF、STAT3蛋白的表达情况，并分析其与临床病理特征之间的关系，进一步明确TAMs在CMM侵袭、转移中的作用，探讨其可能的作用机制。方法1巨噬细胞的诱导及表型鉴定采用PMA将人单核细胞株U937诱导为巨噬细胞，流式细胞仪检测巨噬细胞CD68的表达情况；分别采用细胞因子LPS和IL-4诱导为M1和M2型巨噬细胞，ELISA法检测M1和M2型巨噬细胞IL-12p70和IL-10表达水平。2TAMs对人恶性黑素瘤细胞A375生物学行为的影响将处于对数生长期的A375细胞接种于Transwell培养板（滤膜孔径0.4μm）下层小室中孵育24h；将不同激活途径的巨噬细胞与接种于Transwell小室（滤膜孔径0.4μm）上层小室，建立体外共培养体系，每24小时采用MTT法检测A375细胞增殖情况，共3天；将与不同激活途径的巨噬细胞共培养48小时后的A375细胞用无血清培养基重悬，接种于Transwell小室（滤膜孔径8μm）的上室面培养24小时，观察滤膜下表面蓝紫色胞浆的细胞，检测不同激活途径的巨噬细胞对A375细胞侵袭力和迁移力的影响。3TAMs在皮肤恶性黑素瘤中的浸润及与STAT3、VEGF蛋白表达间的关系采用免疫组化法分别检测CMM组织和色素痣组织中CD68（标记TAMs）及VEGF、STAT3蛋白的表达情况，并分析其与临床病理特征之间的关系。结果1巨噬细胞的诱导及表型鉴定1) PMA诱导的巨噬细胞经流式检测表达巨噬细胞抗原CD68。2) LPS及IL-4激活后的巨噬细胞分别表现为IL-12p70highIL-10low和IL-12p70lowIL-10high，表明M1型和M2型巨噬细胞诱导成功。3) PMA诱导的巨噬细胞（Mφ）IL-12p70、IL-10的分泌水平与M2型巨噬细胞更为接近。2TAMs对人恶性黑素瘤细胞A375生物学行为的影响1) IL-4激活的M2型巨噬细胞促进A375细胞的增殖、侵袭和迁移；LPS激活的M1型巨噬细胞抑制A375细胞的增殖、侵袭和迁移。2) PMA诱导的巨噬细胞（Mφ）更倾向于M2细胞的表型，对A375细胞的增殖、侵袭和迁移起促进作用。3TAMs在皮肤恶性黑素瘤中的浸润及与STAT3、VEGF蛋白表达间的关系1) CMM组织中TAMs浸润与STAT3、VEGF蛋白的表达密切相关，且三者均与Clark分级和有无淋巴结转移有关。2) TAMs可能通过调节STAT3、VEGF蛋白的表达，对CMM的发生和发展起促进作用，有望为CMM的靶向性治疗提供新思路。结论巨噬细胞可以在体外被成功诱导激活成不同表型，为巨噬细胞体外相关性研究带来了可能。M2型巨噬细胞促进A375细胞增殖、侵袭和迁移，起“促癌”作用，而M1型巨噬细胞则起相反作用。CMM组织中TAMs浸润与STAT3、VEGF蛋白的表达密切相关，且三者均与Clark分级和有无淋巴结转移有关。TAMs可能通过调节STAT3、VEGF蛋白的表达，对CMM的发生和发展起促进作用，有望成为CMM的靶向性治疗提供新思路。我们推测：在恶性黑素瘤组织中TAMs可能主要是以替代激活的M2型巨噬细胞表型存在，起“促癌”作用；TAMs可能通过上调STAT3、VEGF蛋白的表达，促进CMM的侵袭和转移。