背景全世界恶性肿瘤中肺癌的发生率和死亡率越来越高,目前已位居世界前列,其中非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%～85%。近年来,随着分子靶向治疗的问世,非小细胞肺癌的治疗取得了突破性的进展。目前国内外均有大型随机对照临床试验证明了分子靶向药物表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制(TKIs)一线治疗具有EGFR基因活化突变的NSCLC患者,疗效显著提高,患者的生存期明显延长。但是,随着分子靶向治疗的发展,耐药问题已成为分子靶向治疗的一个瓶颈。临床上发现,晚期NSCLC中同样具有EGFR基因活化突变的患者,在接受EGFR-TKIs治疗后疗效存在较大的差异,并且最终都会出现耐药而导致治疗失败。目前已明确的EGFR-TKIs耐药机制有EGFR基因20外显子T790M突变、cMET扩增。在EGFR突变型NSCLC并对EGFR-TKIs继发性耐药的标本中,约50%检出了EGFR基因20外显子T790M突变,约20%检出了cMET基因扩增。近年来研究提示,EGFR-TKIs耐药问题还可能和EGFR基因突变异质性有关,即同一瘤灶的不同部分,同一患者的不同瘤灶以及同一瘤灶治疗前后EGFR基因突变状态都有可能不一致。目前对于具有EGFR基因活化突变的NSCLC患者肿瘤中究竟是否存在EGFR基因突变异质性及这种异质性与EGFR-TKIs耐药的相关性,研究还存在争议。恶性肿瘤的发生、发展是一个多阶段、多步骤的演进过程,有研究表明EGFR基因突变在肺腺癌中是一种早期事件,在这种早期就已经发生EGFR基因突变的肺腺癌组织中,随着细胞的克隆性生长,癌组织中EGFR突变应该具有较高的同质性。但是也有研究表明细胞在克隆性生长过程中可能受到复杂微环境的影响而发生各种不同的变化,从而造成分子水平中基因及组织水平中病理类型的异质性。实体瘤内正常细胞的混杂是造成EGFR基因突变异质性研究存在争议的一个重要原因。单细胞基因分析技术是一种更科学、更灵敏的生物学技术,可深入探索肿瘤内部的基因异质性。全自动激光捕获显微切割仪和流式细胞仪的发展使单细胞获取成为可能。单细胞聚合酶链反应(PCR)和单细胞测序技术广泛应用于微生物领域的单细胞基因研究、植入前基因诊断(PGD)的单基因突变研究、异质性肿瘤的基因表达特点研究中。也有文献报道：建立在单细胞PCR基础上对单个细胞进行EGFR基因检测是可行的。因此,从单细胞水平可以对肿瘤内部的EGFR基因突变异质性进行更深入、全面的研究。目的本研究首先采用流式细胞仪分选肿瘤细胞株中的单个细胞,进行单细胞多聚酶链反应(PCR)扩增EGFR基因单个外显子及单细胞测序,探讨单细胞PCR扩增和测序技术的可行性,在此基础上,采用显微切割技术捕获EGFR活化突变阳性患者肿瘤组织切片中的单个肿瘤细胞,进行单细胞PCR扩增和单细胞测序,从单细胞水平探讨晚期NSCLC患者肿瘤组织内是否存在EGFR基因突变异质性及其与EGFR-TKIs疗效的关系。第一部分单细胞PCR扩增和测序技术可行性的研究方法1.细胞株的选取选取H1975和PC-9两种肿瘤细胞株,这两种细胞株均是经单个细胞克隆培养起来的,前者同时具有EGFR基因20外显子T790M和21外显子L858R杂合突变的特点,后者则具有EGFR基因19外显子缺失的特点。2.单细胞混悬液的制备在细胞培养瓶中分别培养H1975和PC-9这两种细胞株,待细胞长势良好,长满培养瓶80～90%时,用胰酶消化细胞,制备这两种细胞株的单细胞混悬液。3.流式细胞仪分选单细胞紫外线消毒流式细胞仪操作台,打开流式细胞仪,设置分选参数,用流式细胞仪分选单个细胞到96孔PCR板中,每排设置一个空白对照孔,用细胞裂解液裂解细胞。4.单细胞PCR扩增用25u1PCR扩增体系,加入Promega酶和EGFR基因相应外显子引物,常规PCR扩增反应条件为：94℃5min；(94℃30sec-58℃45sec-72℃45sec)×40cycles；72℃7min；4℃forever.单个H1975细胞EGFR基因21外显子巢式PCR扩增第一轮反应条件：95℃5min；(95℃30sec-61℃30sec-72℃30sec)×40cycles；72℃7min；4℃forever；第二轮反应条件:95℃5min；(95℃30sec-58℃30sec-72℃30sec)×40cycles；72℃7min；4℃forever.单细胞PCR扩增后用2%琼脂糖凝胶电泳观察,出现目的条带表示单细胞PCR扩增阳性。5.单细胞测序对单细胞PCR扩增出目的条带的单细胞进行EGFR基因测序：纯化→正反向引物标记→纯化→加入10ul HD应用测序仪测序。H1975细胞测序结果应该显示EGFR基因20外显子T790M杂合突变或21外显子L858R位点杂合突变,PC9细胞则显示EGFR基因19外显子缺失。6.统计分析6.1分别计算单细胞PCR方法扩增EGFR基因19、20、21外显子的扩增效率：如果2%琼脂糖凝胶电泳图上显示有目的条带,表示此细胞扩增阳性,单细胞PCR扩增阳性的细胞数与扩增细胞总数的比值即为单细胞的PCR扩增效率。6.2计算等位基因脱扣(Allele drop-out, ADO)的发生率：ADO指单个细胞在单细胞PCR扩增过程中只扩增出细胞中的一个等位基因,从而使具有杂合突变特点的细胞表现出纯合突变或者变为突变野生型,主要发生在单细胞单基因突变的研究中。所以,具有20和21外显子杂合突变特点的单个H1975细胞测序结果若为纯合突变或者野生型,则表示该细胞发生了ADO。结果1、单细胞PCR扩增效率1.1、PC9-EGFR-19EXON的常规PCR扩增：应用流式细胞仪从PC9细胞混悬液中分选出84个PC9细胞,2%琼脂糖凝胶电泳显示出目的条带的有71个,常规PCR扩增效率达84.5%(71/84)。1.2、H1975-EGFR-20EXON-T790M的常规PCR扩增：流式细胞仪分选了70个H1975细胞进行EGFR基因20外显子常规PCR扩增,2%琼脂糖凝胶电泳显示有57个H1975细胞扩增阳性,有效率达81.4%(57/70)。1.3、H1975-EGFR-21EXON-L858R的常规PCR扩增：分选出的84个H1975细胞进行EGFR基因21外显子常规PCR扩增,2%琼脂糖凝胶电泳显示72个H1975细胞扩增阳性,有效率达85.7%(72/84)。1.4、H1975-EGFR-21EXON-L858R的巢式PCR扩增：总共分选了104个H1975细胞进行巢式PCR扩增EGFR基因21外显子,2%琼脂糖凝胶电泳显示100个H1975细胞扩增阳性,有效率达96.2%(100/104)。2、单细胞EGFR基因测序结果2.1、PC9-EGFR-19DEL:71个扩增阳性的PC9细胞进行EGFR基因19外显子测序,结果均显示有EGFR基因19外显子的缺失。2.2、H1975-EGFR-20EXON-T790M:57个扩增阳性的H1975细胞进行EGFR基因20外显子测序,结果显示T790M杂合突变的有50个,7个纯合突变,等位基因脱扣率为12.3%(7/57)。2.3、H1975-EGFR-21EXON-L858R:72个常规PCR扩增阳性的H1975细胞中,测序成功的有71个,其中67个显示杂合突变,4个纯合突变,等位基因脱扣率为5.6%(4/71)。2.4、H1975-EGFR-21EXON-L858R:总共有100个巢式PCR扩增阳性的H1975细胞,测序结果显示EGFR基因21外显子L858R杂合突变的有93个,纯合突变的有4个,野生型的有3个,等位基因脱扣率为7.0%(7/100)。结论应用流式细胞仪从单细胞混悬液中分选出单个细胞对其EGFR基因单个外显子进行PCR扩增和测序在方法上是可行的,尤其是应用单细胞巢式PCR扩增方法扩增EGFR基因21外显子时,其扩增效率更高,特异性强。第二部分肿瘤组织内EGFR基因突变异质性的研究方法1、标本选择总共选取了6例标本进行研究,这6例患者具有以下几个特点：(1)就诊于广东省人民医院肺科,接受过手术切除治疗；(2)病理类型均为肺腺癌；(3)直接测序法提示具有EGFR第21外显子L858R点突变；(4)晚期曾接受过EGFR-TKIs治疗；(5)在广东省人民医院肺癌研究所标本库中均保存有手术切除的新鲜冰冻癌组织,癌组织均取自肺部原发肿瘤；(6)所有患者均签署了标本采集和使用知情同意书。这6例患者接受EGFR-TKIs治疗的无进展生存时间(progression free survival, PFS)分别为22、19、15、5、3、1个月,根据PFS时间长短把这6例患者分为两组：一组为PFS时间较长的,PFS时间均大于14个月,共3例患者；另一组为PFS时间较短的,PFS时间均小于6个月,共3例患者。2、切片染色把这些癌组织从-80℃冰箱中取出进行冰冻切片、苏木精染色,然后分别用75%乙,醇、95%乙醇、100%乙醇进行阶梯性脱水各10s及二甲苯透明5分钟,最后把玻片放置在通风柜中风干。3、激光捕获显微切割(LCM)获取单个肿瘤细胞用全自动激光捕获显微切割仪捕获癌组织切片上的单个肿瘤细胞,每例标本捕获20～24个肿瘤细胞,加入裂解液裂解细胞。4、单个肿瘤细胞的巢式PCR扩增加入巢式PCR扩增所需的原料、酶、引物进行EGFR基因21外显子扩增。然后根据2%琼脂糖凝胶电泳有无目的条带出现判断单细胞巢式PCR扩增是否阳性。5、单个肿瘤细胞的直接测序对巢式PCR扩增阳性的肿瘤细胞进行EGFR基因21外显子测序：纯化→正反向引物标记→纯化→加入10u1HD应用测序仪测序。观察EGFR基因21外显子序列有无L858R位点突变。6、应用SPSS13.0统计软件进行统计分析。计算每例标本中捕获的肿瘤细胞的巢式PCR扩增效率和EGFR基因21外显子突变率。计算两组标本(PFS大于14个月和PFS小于6个月)中捕获的肿瘤细胞的巢式PCR扩增效率及EGFR基因21外显子突变率。采用卡方检验分别比较两组标本(PFS大于14个月和PFS小于6个月)中肿瘤细胞的巢式PCR扩增效率及EGFR基因21外显子突变率的差别。以α=0.05(双侧)为检验水准,P<0.05为有统计学意义。结果1.单细胞巢式PCR扩增效率和EGFR基因测序结果6例具有EGFR基因21外显子活化突变的标本中共捕获135个肿瘤细胞,EGFR基因21外显子的巢式PCR扩增有效率为88.9%(120/135),测序结果显示EGFR基因21外显子突变率和野生率分别为77.5%(93/120)、22.5%(27/120)。每例标本中捕获的肿瘤细胞的巢式PCR扩增效率分别为82.6%、87.5%、82.6%、90.0%、91.3%、100%,而对应的每例标本中捕获的肿瘤细胞的EGFR基因21外显子突变率分别为89.5%、81.0%、89.5%、72.2%、66.7%、68.4%。PFS大于14个月一组肿瘤细胞的巢式PCR扩增效率为84.2%(59/70),肿瘤组织内肿瘤细胞的EGFR基因21外显子突变率和野生率分别为86.4%(51/59)、13.6%(8/59)。PFS小于6个月一组肿瘤细胞的巢式PCR扩增效率则为93.8%(61/65),肿瘤组织内肿瘤细胞的EGFR基因21外显子突变率和野生率分别为68.9%(42/61)、31.1%(19/61)。2.两组标本中肿瘤细胞的单细胞巢式PCR扩增效率及EGFR基因21外显子突变率的比较结果。在PFS大于14个月和小于6个月两组标本的肿瘤细胞中,单细胞巢式PCR扩增效率的差异无明显统计学意义(χ2=3.119,P=0.077)。PFS大于14个月的癌组织内肿瘤细胞的EGFR基因21外显子突变率(86.4%)高于PFS小于6个月一组的突变率(68.9%),差异有统计学意义(Z=5.321,P=-0.021)。结论1、应用全自动激光捕获显微切割仪(LCM)从肿瘤组织中捕获单个肿瘤细胞对其EGFR基因21外显子L858R位点进行巢式PCR扩增和测序在方法上是可行的。2、EGFR基因21外显子L858R位点突变阳性肺腺癌患者的肿瘤组织内存在EGFR基因活化突变异质性,这种异质性可能和EGFR-TKIs的治疗疗效相关。