论文部分内容阅读
黄瓜是一类重要的蔬菜作物,在世界上被广泛栽培。果实中积累葫芦素C会导致黄瓜苦味,严重影响黄瓜品质。从根本上真正解决黄瓜苦味问题,必须弄清楚黄瓜苦味形成的机制,才能为后续利用分子育种工具改良黄瓜品质打下坚实的科学基础。真核生物中,转录水平的调控是基因表达调控的主要方式。本研究使用黄瓜cDNA文库,通过酵母单杂交技术筛选与苦味物质生物合成调控相关的转录因子。主要结果如下：从华北型黄瓜9930中克隆苦味生物合成基因簇的启动子序列并构建到酵母单杂交报告载体pHIS2上。pHIlS2-BPr报告载体转化酵母Y187,获得能够消除报道基因在酵母细胞中的本底表达的最适3-AT浓度(15mM),此浓度作为后续筛选黄瓜cDNA文库的3-AT工作浓度。使用酵母单杂交技术,对黄瓜cDNA文库进行多次筛选,共鉴定出16个转录因子,其中有4个bHLH家族、4个bZIP家族、4个AP2/ERF家族、2个MYB家族和2个锌指蛋白。候选转录因子通过恢复验证及与p450氧化酶进行一对一的激活验证,筛选出的4个转录因子可以激活黄瓜苦味物质生物合成基因簇的表达,分别是Csa3G270(bHLH)、Csa6G020(bZIP)、Csa4G970(bZIP)和Csa5G220(bHLH).构建含有荧光素酶的报告载体和连有候选转录因子的效应载体,利用农杆菌渗透法直接转化烟草植株上的叶片,进行转录因子的瞬时表达分析。结果证明Csa3G270(bHLH)、Csa4G970(bZIP)和Csa5G220(bHLH)可以激活黄瓜苦味物质生物合成基因簇的表达。通过原核表达纯化系统,构建原核表达载体pET32a-Csa5G220,诱导纯化Csa5G220基因表达的融合蛋白。Csa5G220基因编码251个氨基酸的蛋白,相对分子量为33KDa,理论等电点为7.54。体外用凝胶阻滞试验进一步验证纯化蛋白与其顺式作用元件的结合能力。