【摘 要】
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目的:通过研究MyD88在结肠癌中激活自噬并抑制凋亡的作用机制,从体内外实验证明熊果酸下调结肠癌细胞中MyD88的表达,从而抑制结肠癌细胞自噬进而促进其凋亡的药效研究,为熊果酸的临床应用提供理论和实验依据。方法:1.CCK8法和流式细胞术检测结肠癌细胞增殖及周期变化。2.利用公司已构建的MyD88基因干扰及过表达慢病毒载体,建立2种细胞系的慢病毒稳转株,用于后续熊果酸下调MyD88作用机制的研究。
【基金项目】
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上海市普陀区临床重点专科——检验医学（2016PTZX）； 国家自然科学基金（青年）（17-GZ-03）；
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目的:通过研究MyD88在结肠癌中激活自噬并抑制凋亡的作用机制,从体内外实验证明熊果酸下调结肠癌细胞中MyD88的表达,从而抑制结肠癌细胞自噬进而促进其凋亡的药效研究,为熊果酸的临床应用提供理论和实验依据。方法:1.CCK8法和流式细胞术检测结肠癌细胞增殖及周期变化。2.利用公司已构建的MyD88基因干扰及过表达慢病毒载体,建立2种细胞系的慢病毒稳转株,用于后续熊果酸下调MyD88作用机制的研究。3.流式细胞术检测结肠癌细胞的凋亡水平,TUNLE法检测裸鼠皮下瘤组织内的细胞凋亡水平。4.应用Transwell小室、划痕实验,验证MyD88对结肠癌细胞迁移的影响。5.建立D-Hank’s饥饿诱导自噬模型,并在此基础上,应用熊果酸处理,验证MyD88基因干扰及过表达后自噬、凋亡水平的变化,并应用PCR、Western blot法验证其对自噬及凋亡相关基因和蛋白的调控。6.裸鼠皮下瘤模型中,应用雷帕霉素诱导自噬,通过熊果酸腹腔注射,研究其通过下调MyD88抑制肿瘤自噬进而促进其凋亡的作用。应用PCR、Western blot法验证其对自噬及凋亡相关基因和蛋白的调控。结果:1.CCK8法显示熊果酸对结肠癌细胞HCT116、HCT8、Lo Vo、SW620、RKO增殖的抑制呈剂量依赖性,其中HCT116的IC50为23.11μM,SW620的IC50为26.7μM,HCT8的IC50为27.44μM,Lovo细胞的IC50是32.02μM,RKO细胞的IC50是42.49μM;流式细胞术结果显示熊果酸用药后细胞周期发生阻滞。2.熊果酸处理后结肠癌细胞凋亡水平明显升高、迁移减少。3.MyD88-OE细胞的增殖较对照细胞明显加快,MyD88-KD细胞的增殖较对照细胞明显减慢;流式细胞术检测结果同样证实MyD88基因干扰后发生了细胞周期阻滞;Transwell小室及划痕实验证实MyD88可以促进结肠癌细胞迁移。4.Western blot结果显示饥饿诱导自噬后的NC组、KD组及OE组较未予饥饿诱导自噬对照组的LC3BⅡ/Ⅰ均升高,其中KD组饥饿诱导自噬后的LC3BⅡ/Ⅰ升高程度最低,OE组饥饿诱导自噬后的LC3BⅡ/Ⅰ升高最显著,ATG7表达水平与LC3BⅡ/Ⅰ趋势相同,P62的表达与LC3BⅡ/Ⅰ的表达相反。5.饥饿诱导自噬并且经熊果酸处理后MyD88-OE细胞凋亡水平较相同处理的MyD88-NC细胞显著降低;裸鼠皮下瘤模型中使用RAP诱导自噬的同时加用熊果酸处理,TUNLE检测结果显示MyD88-OE-RAP-UA组的凋亡水平较MyD88-NCRAP-UA组明显降低。6.凋亡相关基因Bax在诱导自噬后明显降低,其中OE组降低最显著;当加用熊果酸处理后,诱导自噬后的OE组并未如NC组一样出现Bax表达的明显升高;Bcl2的表达与Bax相反;Caspase3表达与Bax表达的趋势一致。结论:1.熊果酸可抑制多个结肠癌细胞的增殖、迁移,并引起细胞周期阻滞,同时可抑制诱导自噬模型中自噬的激活并促进结肠癌细胞的凋亡,最终实现抑制结肠癌细胞生长。2.MyD88促进结肠癌细胞增殖、迁移并可抑制凋亡,其激活自噬后可进一步抑制细胞凋亡。3.本实验通过体内外诱导自噬模型证明MyD88通过ATG7激活结肠癌细胞自噬,ATG7促进与P62形成复合体的LC3-Ⅰ被分解为LC3-Ⅱ,溶酶体降解自噬体进一步导致P62水平降低;P62降低后,对Bcl2的抑制作用减弱,Bcl2表达增高且Bax表达降低,引起Caspase3活化受阻,最终引起凋亡水平下降。4.熊果酸通过下调MyD88抑制结肠癌细胞自噬激活进而促进其凋亡。
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