研究背景线粒体病(mitochondrial diseases)一组由线粒体DNA (mtDNA)或核DNA(nDNA)缺陷导致的线粒体结构和功能障碍、ATP合成不足所致的多系统疾病,包括：原发性线粒体病,由编码线粒体功能相关蛋白的基因突变引起的；继发性线粒体病,由药物、环境、感染等引起。该病于1959年被首次报道,此后几十年越来越多的疾病发现与线粒体功能异常有关,这其中不仅包括基因突变导致线粒体病,也包括一些常见疾病,例如糖尿病、肿瘤、肥胖、阿尔兹海默病、帕金森病、亨廷顿病和原发性癫痫等。Holt于1988年首次在线粒体肌病患者中发现mtDNA缺失,28年来,通过对线粒体患者及其家系的研究,几百种致病性核基因和线粒体基因被发现,从而证实了核基因和线粒体基因突变是原发性线粒体病的重要遗传因素。如mtDNA点突变可以导致线粒体脑肌病伴高乳酸血症、卒中样发作(MELAS),mtDNA单一大片段缺失引起眼外肌麻痹(CPEO),核基因Twinkle的致病突变可以导致家族性的眼外肌麻痹等。随着测序技术的发展,尽管越来越多的致病病基因被发现和报道,但是依然有很多未解的问题：①线粒体病基因型和表型多样性,临床复杂多样,受累器官不同,各年龄均可发病,这对于线粒体的诊断是个难题。②同一种致病性突变可以导致截然不同的临床表现,特殊的线粒体病亚型可以表现为特异性组织损害；③线粒体病的治疗,目前对于预防发作和延缓进展的治疗还是非常有限。自从成纤维细胞生长因子21在2005年被发现以来,由于其在机体能量代谢调控方面的广泛作用,引起了国内外研究团队的广泛兴趣。FGF21作为成纤维细胞生长因子(FGF)家族中特殊的一员,具有许多内分泌功能。FGF21和其他成纤维细胞因子家族不同,FGF21可以被分泌到血液中,作用于全身各个系统。人类的FGF21由187个氨基酸组成,主要由肝脏分泌,调节机体的葡萄糖和脂肪的代谢。研究发现：正常情况下,血液中的FGF21的浓度很低,在饥饿和酮体饮食的情况下,血中FGF21的浓度明显升高。此外,二型糖尿病、冠心病、肝功能异常等疾病都可以导致血FGF21轻度的升高。近期的研究发现,在线粒体病的小鼠模型以及线粒体病患者中,血清FGF21水平升高。虽然FGF21因子的作用在许多病理过程中被报道和研究,但是它们在线粒体病中的作用却一直未被阐明,此外关于FGF21如何调节细胞线粒体的功能的研究也很少。线粒体是细胞内三大物质代谢的主要场所,因此线粒体的功能缺陷可以导致糖、脂肪酸和氨基酸代谢的异常,不仅表现为血乳酸、丙酮酸和丙氨酸的异常,也可以引起尿液中物质代谢中间产物的升高,如2-氧戊二酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐、苹果酸盐等。线粒体功能异常情况下,机体通过正反馈和负反馈机制对物质和能量代谢状态进行重新调控,最大限度地对线粒体的功能缺陷进行代偿,保证细胞相对正常的生理状态。这种能量代谢的调控机制被称为线粒体能量代谢重构。线粒体功能缺陷引起的能量代谢重构主要依赖于以线粒体为中心的生物能学体系。细胞内ATP、acetyl-CoA、NAD+、SAM的水平可直接影响DNA的甲基化、组蛋白的乙酰化以及蛋白的磷酸化和乙酰化水平,并通过上述因子重新调控细胞的能量代谢过程。为此,本课题围绕线粒体病基因型—临床表型异质性和能量代偿调控机制进行了以下几方面的工作：第一部分线粒体病中FGF21介导的能量代谢重构代偿线粒体功能缺陷的机制研究研究目的本部分围绕线粒体病中FGF21细胞因子如何重构整个机体的能量代谢过程,采用分子干预和体外实验研究的手段,明确FGF21在以肌肉损害为主的线粒体病患者肌肉标本中是否升高,阐明FGF21对机体能量代谢的影响,探索线粒体病基因型—临床表现关系复杂多变的机制。材料方法1)利用SYBR GREEN实时定量PCR方法检测分析线粒体病患者肌肉组织内FGF21 mRNA的表达,蛋白免疫电泳的方法分析线粒体病肌肉组织中FGF21蛋白的表达。2)利用线粒体呼吸链抑制剂,如鱼藤酮、寡霉素,以及解偶联剂FCCP诱导成肌细胞线粒体的功能障碍3)利用SYBR GREEN实时定量PCR方法检测分析FGF21诱导前后,肌细胞物质代谢相关基因的表达情况4)采用mtDNA数量、细胞内ATP含量、柠檬酸合酶活性以及线粒体ROS水平等方法评估成肌细胞的线粒体功能5)海马细胞能量分析仪测量细胞氧耗量和细胞外酸化率,获得细胞基础呼吸率、ATP产生量、质子漏、最大呼吸率、细胞基础糖酵解率以及最大糖酵解能力等指标。6)通过分析成肌细胞最大呼吸率评估细胞抵抗ROS的能力。7)蛋白免疫组化分析FGF21处理后,成肌细胞内mTOR-PGC1 α等信号通路的变化。8)雷帕霉素抑制mTOR蛋白激酶的活性,LY294002抑制PI3K-Akt通路。9)shRNA减少YY1和PGC1 α转录因子的表达,明确它们在FGF21促进能量代谢方面作用的分子机制。实验结果线粒体脑肌病患者肌肉组织内FGF21表达明显升高,线粒体呼吸链抑制剂诱导的线粒体损伤能够上调肌细胞FGF21的表达；FGF21因子能够促进肌细胞线粒体代谢相关基因(CPT1A, CPT2, PPARy,IDH3A, GLUT1)的表达翻译,增加成肌细胞mtDNA的数量,增强线粒体柠檬酸合酶的活性,增加细胞内ATP的含量,增加成肌细胞的氧气消耗率和促进细胞的糖酵解过程。FGF21促进成肌细胞能量代谢过程是通过激活细胞内mTOR-YY 1-PGC1 α信号通路实现的,雷帕霉素、shRNA降低PGCl α的表达能够减弱FGF21的这种促进作用。伴有线粒体功能障碍的一种组织可以通过分泌FGF21细胞因子重构整个机体的能量代谢过程。血清中升高的FGF21细胞因子,一方面作用于肝脏导致酮体的产生；另一方面作用于脂肪组织,导致脂肪的分解；这些酮体和脂肪酸可以被肌肉、脑等其他器官组织摄取和利用。实验结论①线粒体脑肌病患者肌肉组织内FGF21表达明显升高；②线粒体氧化呼吸功能异常可以引起肌细胞内FGF21细胞因子水平的升高,肌肉细胞通过分泌FGF21因子来代偿线粒体能量代谢的异常；③肌肉组织通过分泌FGF21细胞因子,一方面作用于肌肉组织本身,激活细胞内的mTOR-YY1-PGC1 α信号通路增强线粒体的功能和氧化呼吸效率,另一方面作用于肝脏和脂肪组织为肌肉供能；④伴有线粒体功能异常的肌肉组织可以通过分泌FGF21因子调控机体的能量代谢过程。第二部分线粒体基因C15620A多态位点影响G11778A突变临床表型的研究研究目的线粒体基因G11778A突变是Leber遗传性视神经病(LHON)的常见致病突变位点,而G11778A突变引起Leigh综合征(LS)确罕有人报道。我们报道一例携带有线粒体G11778A突变的LS患者的临床和病理特点,并探讨线粒体基因多态性位点C15620A对致病突变G11778A临床表型的影响。材料方法采集一例临床表现为LS的3岁汉族儿童相关病史、体格检查以及其他辅助检查资料,完善血、脑脊液乳酸、血尿有机酸、血脂酰肉碱和视神经检查,并行肌肉活检和线粒体基因全长序列分析,以明确致病突变位点。分离培养患儿的皮肤成纤维细胞,对其进行线粒体呼吸链酶活性分析、细胞线粒体膜电位及细胞ATP含量检测分析,以明确患儿的线粒体功能。实验结果该患儿自幼发育较同龄儿慢,一岁八个月会走,两岁会说话,在两岁十个月的时候开始出现意向性震颤、右眼内斜视和走路不稳。神经系统查体发现右眼内斜视,走路不稳和共济失调,眼底检查未见明显异常。颅脑MRI显示双侧延髓、脑桥、中脑及小脑对称性的长T1长T2信号,FLARI呈高信号。空腹血乳酸6.0mmol/L(正常值<1.55mmol/L);脑脊液乳酸3. lmmol/L。肌肉切片酶组织化学染色提示部分肌纤维肌膜下琥珀酸脱氢酶活性增强。线粒体基因分析发现G11778A致病突变,其在肌肉组织突变率为91.6%,外周血的突变率为57%；同时并合并一个新的C15620A非致病突变,其在肌肉组织突变率分别为90%；患儿母亲的外周血中也发现了这两种突变,突变率分别是57%和79%。同时,患儿皮肤成纤维细胞呼吸链复合体Ⅰ活性、复合体Ⅲ酶活性和线粒体膜电位分别降低了67%、15%和50%。 C15620 A非致病突变可能通过降低复合体Ⅲ酶的活性而影响GI1778A致病突变的临床表型。实验结论线粒体基因GI1778A致病突变可以引起Leigh综合征。线粒体基因C15620A多态位点可能过降低复合体Ⅲ酶的活性而影响致病性GI1778A突变的临床表型,表现为Leigh综合征。第三部分Twinkle基因突变导致的家族性眼外肌麻痹的两例家系报道研究目的总结家族性眼外肌麻痹患者的肌肉病理、基因和临床表现的特点,分析Twinkle基因突变引起眼外肌麻痹的肌肉病理表现和临床特点。材料方法收集整理齐鲁医院神经肌肉研究室2005年以来的两例家族性眼外肌麻痹家系患者的临床及其他辅助检查资料,完善血乳酸、血脂酰肉碱及尿有机酸等检查,总结肌肉活检病理表现,Twinkle基因测序分析明确致病位点。总结文献资料,概括归纳Twinkle基因致病性突变的各种类型及其表型。实验结果这两个家系中的患者临床表现相对较轻,仅表现为轻-中度的眼睑下垂、轻度的眼外肌麻痹和进行性的肌无力。肌肉病理主要表现为少量的RRFs和COX酶活性缺失纤维。Twinkle基因测序分析发现了两个已报道的致病性突变,分别是c.1423G>C,p.A475P和c.1061G>C,p.R354P。对两个家系的先证者肌肉mtDNA分析发现,它们都存在多发缺失突变。实验结论Twinkle基因是家族性眼外肌麻痹的常见致病基因,p.A475P和p.R354P突变是常见的致病突变位点,它引起的临床表现相对较轻,肌肉病理主要特点是少量散在分布的破碎样红纤维(RRFs)和COX酶活性缺失纤维。