一、背景恶性黑色素瘤是侵袭性最强的皮肤恶性肿瘤之一,其主要治疗方式包括手术、化疗、免疫治疗和靶向治疗等。化疗药物在体内易被清除,且特异性及肿瘤靶向性较低,会对正常组织器官产生严重毒性。因此,开发药物递送系统,从而高效地将药物靶向输送到病变组织、延长药物血液循环时间和最大程度降低副作用,是至关重要的。近年来,材料科学、纳米技术、细胞工程、基因重组等技术的研究和发展极大的丰富了药物递送系统的选择。其中,直接将肿瘤细胞膜包覆在纳米材料表面,制备肿瘤仿生纳米材料可以实现肿瘤靶向、控制性药物释放以及免疫激活等。但是,由于细胞膜提取和包覆过程复杂且包覆率不高,因此用活细胞直接作为药物递送平台是更优选择。利用中性粒细胞（PMN）的肿瘤趋化能力,将纳米粒子和药物携带到肿瘤部位是一种有效的递药策略。肿瘤疫苗作为免疫治疗的一种,旨在重新激活免疫系统以识别和消除肿瘤细胞,并产生免疫记忆防止癌症复发。肿瘤细胞疫苗是利用完整的细胞或者细胞裂解物,自体癌细胞还具有患者特异性抗原,可诱导肿瘤特异性的免疫反应。将肿瘤疫苗与抗肿瘤药物结合,可以在直接杀伤肿瘤的同时,高效激活免疫系统,清除剩余的癌细胞,减少肿瘤复发。结合前人的研究,本论文设计了三种基于细胞及细胞组分的药物递送系统,递药系统一提取B16F10细胞膜包覆负载光热剂吲哚菁绿（ICG）和化疗药阿霉素（DOX）的中空纳米硫化铜（HCu SNPs）（ID-HCu SNP@B16F10）,递药系统二提取PMN结合ABTS修饰的Fe C（Fe C@ABTS）,两种递药系统分别利用癌细胞的同源靶向能力以及PMN对肿瘤的趋化能力,增加药物在肿瘤部位的蓄积并且延长滞留时间;递药系统三通过液氮处理B16F10细胞,消除其致瘤性,保留完整的细胞结构和肿瘤抗原,在其细胞核内负载DOX,在对肿瘤进行化疗的同时激活免疫系统。本论文分别对这三种递药系统进行了表征,探究其抗肿瘤和成像能力,总结各自的优缺点,为今后药物递送平台的设计提供研究基础和依据。二、研究内容及方法（一）癌细胞膜包被的HCu SNPs介导黑色素瘤光声成像及治疗合成HCu SNPs,测定粒径和电位,透射电镜观察形态。提取B16F10细胞膜,western blot（WB）表征其纯度。合成ID-HCu SNP@B16F10,透射电镜及WB表征细胞膜是否包覆成功,测定其负载及释放DOX和ICG的能力,及纳米粒子的光热性能。研究纳米粒子的细胞毒性和体外光热杀伤癌细胞的能力;构建小鼠黑色素瘤模型,探究ID-HCu SNP@B16F10的体内光声成像及治疗黑色素瘤的能力及体内生物相容性。（二）PMN递送Fe C@ABTS介导核磁共振成像（MRI）及黑色素瘤治疗合成Fe C@ABTS,测量其粒径及电位。提取小鼠腹腔来源PMN,与Fe C@ABTS结合,并用Diff-Quik染色及透射电镜进行表征。研究纳米材料的光热能力和MR成像能力;探究PMN催化H2O2与ABTS的反应机制。对PMN-Fe C@ABTS的细胞毒性和体外光热杀伤癌细胞的能力进行研究;构建小鼠黑色素瘤模型,研究PMN-Fe C@ABTS体内MR成像能力。对于体内抗肿瘤能力,在治疗后监测小鼠体重和肿瘤体积;取器官进行H＆E染色,血液进行血常规和肝肾功能相关指标检测研究体内生物相容性。（三）同源肿瘤细胞疫苗介导黑色素瘤治疗及预防液氮处理获得LNF细胞,用Diff-Quik染色、扫描电镜、细胞骨架荧光染色观察细胞结构和形态;免疫荧光染色、WB表征gp100的表达;CCK-8检测LNF细胞的增殖能力;研究LNF细胞负载和释放DOX的能力。提取小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDCs）,检测LNF细胞体外激活BMDCs的能力。在黑色素瘤动物模型中,对LNF-DOX在有或没有免疫佐剂R848时的体内抗肿瘤能力进行实验。监测肿瘤体积和小鼠体重,并用流式细胞术和ELISA检测免疫激活情况。对LNF细胞与R848联用抑制B16F10细胞系体内成瘤的能力进行了实验,监测肿瘤体积和小鼠体重,并在不同时间点对免疫激活情况进行检测。三、研究结果（一）癌细胞膜包被HCu SNPs介导黑色素瘤光声成像及治疗1、HCu SNPs是具有介孔结构的球形,提取的B16F10细胞膜纯度较高。HCu SNPs具有较强的负载DOX或ICG的能力,ID-HCu SNP@B16F10对药物的释放为激光诱导型。2、纳米粒子的光热性能较好,ICG可以提升递药系统ID-HCu SNP@B16F10的光热效应。HCu SNPs的细胞毒性较小;ID-HCu SNP@B16F10有较强的光热杀伤癌细胞的能力。3、体内实验中,ID-HCu SNP@B16F10具有靶向黑色素瘤的能力,在肿瘤中的蓄积量约为ID-HCu SNPs的两倍,还可用于光声成像。ID-HCu SNP@B16F10+激光可有效缩小肿瘤体积,且生物相容性较好。（二）PMN递送Fe C@ABTS介导MR成像及黑色素瘤治疗1、成功合成Fe C@ABTS,电位为-6.33 m V,粒径为280 nm左右。PMN与Fe C@ABTS成功结合,并且部分Fe C@ABTS被PMN内吞。2、PMN可以催化ABTS和H2O2的反应,反应产物与HRP的催化产物相同。抑制PMN中的MPO后,催化现象消失,说明MPO是反应中的关键催化酶。3、Fe C的光热性能较好;H2O2可以提升PMN-Fe C@ABTS的最高温度,抑制MPO后,该现象消失。Fe C的细胞毒性较小,PMN-Fe C@ABTS对癌细胞有一定的杀伤能力,可能是因为体系中存在PMN。PMN-Fe C@ABTS具有较强的光热杀伤癌细胞的能力,并且H2O2可以提升该能力。4、体外MR成像结果显示,Fe C纳米粒子的弛豫度为70.864 m M-1s-1,与临床应用的造影剂类似。体内T2-MRI结果说明,PMN可以提升Fe C@ABTS在肿瘤部位的蓄积及滞留时间。5、PMN-Fe C@ABTS可有效靶向黑色素瘤,在肿瘤中的蓄积量是Fe C@ABTS的2.5倍左右。PMN-Fe C@ABTS+激光可以有效缩小肿瘤体积。且小鼠体重监测、H＆E染色及血常规和肝肾功能检测结果表明生物相容性较好。（三）同源肿瘤细胞疫苗介导黑色素瘤治疗及预防1、LNF细胞保留了完整的细胞结构和gp100的表达,细胞直径比B16F10小。DOX能成功负载入LNF细胞的细胞核,并且在37℃下在3 h内缓慢释放。2、LNF细胞在有或没有R848存在的条件下均可以促进BMDCs的成熟,CD11c+CD80+CD86+细胞的比例增加,细胞培养上清中IL-10、IL-12和TNF-α的浓度也较阴性对照组高。3、DOX在负载入LNF细胞核内后,其癌细胞杀伤能力未受到明显影响。在与R848共同给药后,LNF-DOX的体内杀伤癌细胞能力得到提升。LNF-DOX/R848还可以增加小鼠脾脏和肿瘤微环境中CD4+和CD8+T细胞的比例,以及血清中IL-12的含量。4、在对小鼠进行4次免疫接种后,对LNF/R848组小鼠进行皮下荷瘤所长出的肿瘤体积明显较对照组小。且在小鼠荷瘤后,脾脏和肿瘤微环境中CD4+和CD8+T细胞比例及血清中IL-12的含量明显升高。四、结论本研究设计了三种基于细胞及细胞组分的药物递送系统,并分别对其进行了材料表征、体内和体外抗肿瘤实验。其中,ID-HCu SNP@B16F10具有较好的肿瘤靶向性,可以用于肿瘤的光声成像,并且联合化疗和光热治疗对肿瘤具有较强的杀伤能力。但是,由于细胞膜提取过程复杂且产率较低,HCu SNPs对机体有潜在毒性,因此不是最佳的药物递送方案。PMN-Fe C@ABTS克服了上述缺点,利用PMN的趋化性增加材料在肿瘤部位的蓄积,Fe C还具有MR成像能力和光热能力。这两个递药系统均能实现黑色素瘤诊疗一体化。但是,小鼠腹腔来源的PMN无法保证每次提取都有足够实验进行的数量,影响进一步研究,因此也不是理想的递药系统。LNF细胞制备简单,细胞结构完整,可以递送DOX对肿瘤进行化疗;且具有较强的激活抗原提呈细胞的能力,可以在体内激活T细胞,进一步增强抗肿瘤效果,还可以作为肿瘤疫苗。因此,在本论文设计的三个递药系统中,虽然LNF细胞依然具有所负载的药物肿瘤有限等缺点,仍是相对比较理想的药物递送平台。