研究背景及目的：原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC;简称肝癌)是全球发病率最高的几大恶性肿瘤之一,其死亡率位居全球恶性肿瘤死亡的第3位。我国为“乙肝大国”,是肝癌的高发地区,发病率和死亡率均居恶性肿瘤排名的第二位,占世界肝癌死亡人数的50%以上。肝癌的治疗手段包括手术切除、肝移植术、放射治疗、介入治疗、微创消融治疗、靶向治疗等。但由于80%的病人在就诊时已失去手术机会,而且手术的病人50%会出现复发或远处转移,因此手术治疗总体疗效不佳。随着三维适形放疗技术(Three-dimensional conformal radiotherapy,3D-CRT)和强调放射治疗(Intensity Modulated Radiation Therapy, IMRT)技术的发展,放射治疗的范围越来越广,它够使肿瘤组织得到更高剂量的照射而减少正常组织的受量。目前肿瘤患者中有三分之一需要接受放射治疗,在一系列的回顾性和前瞻性研究中,对于不能接受手术的肝癌患者,放射治疗被确定为一种安全有效的局部治疗手段。然而,正常肝脏是放射敏感器官,全肝照射大于40Gy时有75%的患者会出现肝功能不全,而肝癌细胞的放射致死剂量为60Gy,明显大于正常肝细胞耐受量,加之我国肝癌患者80%以上合并不同程度肝硬化,进一步降低了肝脏的放射耐受性。因此,如何提高肝癌细胞的辐射敏感性,提高肝癌放疗疗效,是肝癌放疗急待解决的关键问题。在肿瘤的发生、发展、存活过程中,PI3K/AKT信号途径占有重要位置。活化的AKT具有多种生物学活性,可通过催化一系列蛋白质磷酸化促进肿瘤细胞生长、增殖,抑制凋亡,促进侵袭和转移,调控内皮生长、血管生成等,并增加辐射敏感性。PTEN分子是PI3K的重要抑制性调节分子。众所周知,基因表达调控具有多个层次,转录后调节与转录起始水平调节一样,也是关键环节。microRNA (miRNA)近年来研究发现的一类非编码小分子RNA,长约17-25核苷酸(nucleotide, nt),它能以碱基互补形式与靶基因高度结合从而降解mRNA或抑制其翻译,从而实现转录后水平对基因表达进行负性调控,与动植物的组织器官发育、细胞分化和凋亡、脂肪代谢等生命活动密切相关,其异常表达将导致重大疾病,例如肿瘤的发生发展。已有研究发现miRNA与肿瘤放疗辐射敏感性密切相关。如Lin28-let7能够通过激活K-Ras基因来重塑肿瘤的放疗敏感性；miR-9和let-7g通过抑制NFkappaB1增强肿瘤辐射敏感性等。miR-20a属于miR-17-92基因簇中一员,在许多常见肿瘤异常表达,并在肿瘤的发生、发展转移中发挥重要的作用。然而,miR-20a在肝癌辐射抵抗中发挥着什么样的作用,目前尚未有研究报道。因此,本课题的研究目的：探讨miR-20a在肝癌辐射抵抗中所扮演的角色及导致这种作用的机制,为肝癌临床放射治疗提供重要理论依据。本课题研究中发现miR-20a可通过抑制PTEN降低肝癌细胞对辐射的敏感性,并明确其是通过抑制PTEN表达从而进一步激活PI3K/AKT通路最终导致肝癌细胞对放疗的抵抗。本研究为miR-20a在肝癌辐射增敏作用中的分子机制提供了新的见解,为临床肝癌的治疗靶点提供了新的理论依据。方法：一.肝癌细胞株和组织标本中miR-20a及PTEN的表达1. qRT-PCR检测肝癌细胞株和组织标本中miR-20a及PTEN的表达收集正常人肝细胞株L02,肝癌细胞株Bel-7402、SMMC-7721、QGY-7701、 HCCLM3及MHCC-97L,提取细胞总RNA,按照TaKaRa逆转录试剂盒说明书,逆转录成cDNA后,qRT-PCR反应检测miR-20a及PTEN的表达水平。收集南方医院2012年10月至2014年3月新鲜肝癌及配对癌旁组织标本28例,荧光定量PCR检测组织标本中miR-20a及PTEN的表达。2. Westernblot检测肝癌细胞株和组织中PTEN的表达收集正常人肝细胞株L02,肝癌细胞株Bel-7402, SMMC-7721, QGY-7701, HCCLM3及MHCC-97L,提取细胞总蛋白,Westernblot检测上述6株细胞中PTEN的表达水平。提取组织总蛋白,Westernblot检测组织标本中PTEN的表达水平。二. MiR-20a对肝癌细胞辐射敏感性的影响1.建立稳定过表达miR-20a的肝癌细胞株LV-miR-20a和LV-con慢病毒上清分别感染细胞,随后采用流式细胞仪分选GFP+细胞,得到稳定表达miR-20a的肝癌细胞。2. miR-20a mimics, inhibitor转染应用脂质体介导的方法转染niR-20a mimics和inhibitor,48h后提取细胞的RNA或蛋白或进行后续的处理。3.MTT实验MTT实验检测细胞体外增殖能力,绘制成生长曲线。4.细胞辐射及平板克隆形成实验细胞经不同剂量辐射后,计算克隆形成率和存活分数,并运用GraphPad Prism 5.0软件进行多靶单击模型曲线拟合。5. Western blot实验处理后的细胞提取总蛋白,检测相关蛋白的表达水平变化。三. MiR-20a调控肝癌细胞辐射敏感性的分子机制1.生物信息学预测miR-20a下游调控靶基因利用三大常用miRNA数据库TargetScan, Pictar和miRBase对miR-20a的靶基因进行预测分析。2.双荧光素酶报告系统验证miR-20a靶基因双荧光素酶报告基因实验检测共转染miR-20a mimics, inhibitor或scramble negative control化学合成物后,带有双荧光素酶报告基因的PTEN的报告基因活性变化,以明确PTEN是否为miR-20a的直接靶基因。3.过表达及沉默miR-20a后PTEN的检测收集过表达和沉默miR-20a后的肝癌细胞,提取细胞总RNA及蛋白,通过qPCR和Western blot检测PTEN mRNA和蛋白的表达水平变化。4.干扰PTEN对肝癌细胞辐射敏感性的影响LV-shPTEN和对照LV-shcon慢病毒悬液分别感染肝癌细胞,随后采用流式细胞仪分选GFP+细胞,得到稳定干扰PTEN的细胞。按照上述方法将细胞分不同剂量不同组进行照射,计算克隆形成率及存活分数,运用GraphPad Prism 5.0软件进行多靶单击模型曲线拟合。5.过表达PTEN对肝癌细胞辐射敏感性的影响按照lipofectamine 2000操作说明进行操作,将pCDNA3.1-PTEN及对照质粒转染至肝癌细胞中。按照上述方法将细胞分不同剂量不同组进行照射,克隆形成实验计算克隆形成率及存活分数,运用GraphPad Prism 5.0软件进行多靶单击模型曲线拟合。6.恢复实验依据阳离子脂质体法将pCDNA3.1-PTEN质粒转染至已构建好的稳定过表达miR-20a肝癌细胞。48h后Western blot检测转染效率,克隆形成实验检测细胞辐射敏感性的变化。按照上述方法将细胞分不同剂量不同组进行照射,克隆形成实验计算克隆形成率及存活分数,运用GraphPad Prism 5.0软件进行多靶单击模型曲线拟合,且Western blot检测相关蛋白的改变。7. PI3K/AKT通路抑制剂LY294002对肝癌细胞辐射敏感性的影响Lipofectamine 2000脂质体介导转染miR-20a mimics和miR-con,将细胞消化铺于6孔板,12h后贴壁加或不加LY294002,设定不同剂量不同照射组,1h后进行照射,计算克隆形成数及存活分数,运用GraphPad Prism 5.0软件进行多靶单击模型曲线拟合。8. Western blot检测相关蛋白表达的变化Westernblot检测细胞加或不加LY294002后相关蛋白在进行辐射后PTENN、AKT及p-AKT的变化。9.体内试验在体内环境下观察miR-20a对肝癌辐射辐射敏感性的影响。绘制肿瘤体积生长曲线,取出的瘤组织液氮中保存,提取瘤组织蛋白,Westernblot检测不同处理组PTEN及p-AKT表达水平的变化。10.统计分析采用SPSS13.0软件进行统计分析,两样本均数的比较采用两独立样本的t检验(Independent-Sample T Test)和单样本t检验,两组以上样本均数比较采用完全随机设计资料的方差分析(One-Way ANOVA),方差齐性检验采用Levene’s Test。裸鼠皮下移植瘤大小的生长曲线比较采用两个重复因素的方差分析。P值<0.05认为有统计学意义。结果：一.肝癌细胞株和组织标本中miR-20a及PTEN的表达1. miR-20a在肝癌细胞株和组织标本中表达升高与正常人肝细胞L02相比,肝癌细胞株Bel-7402、SMMC-7721、QGY-7701、 HCCLM3和Bel-7404等5株细胞miR-20a表达水平升高,差异具有统计学意义(*P值均小于0.05)。肝癌组织标本中miR-20a表达升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。2.肝癌细胞株和组织标本中PTEN表达降低与正常人肝细胞L02相比,肝癌细胞株Bel-7402、SMMC-7721、QGY-7701、 HCCLM3和Bel-7404等5株细胞PTEN mRNA的表达水平降低,差异具有统计学意义(*P值均小于0.05),且miR-20a表达较高的细胞株PTEN表达水平相对较低。qRT-PCR检测肝癌组织标本中PTEN的表达,发现PTEN在肝癌组织中表达较癌旁低,且与niR-20a表达水平呈负性相关(P=0.000, spearman’s r=-0.917)。Westernblot结果提示PTEN在肝癌组织中表达较癌旁低。二.miR-20a诱导肝癌细胞发生辐射抵抗1. miR-20a对肝癌细胞体外增殖能力无影响平板克隆实验结果显示在肝癌细胞株Bel-7402及SMMC-7721过表达miR-20a后胞克隆形成数目与对照组相比,经统计分析差异无统计学意义(P>0.05),提示其对肝癌细胞克隆形成能力明显无影响。MTT实验结果显示,过表达或沉默miR-20a对肝癌细胞体外增殖能力无明显影响,差异无统计学意义(P>0.05)。2.过表达miR-20a增强肝癌细胞辐射抵抗建立稳定过表达miR-20a的肝癌细胞株Bel-7402 (t= 21.202,P=0.002,)及SMMC-7721 (t= 11.082,P=0.008);通过平板克隆形成实验,计算克隆形成率及存活分数,多靶单击模型进行曲线拟合。结果显示,过表达miR-20a联合放疗,与空白及LV-con组相比,克隆形成率升高,细胞存活分数增加(tBel-7402=-5.635, PBel-7402=0.005; tSMMC-7721=-5.097, PSMMC-7721=0.007),差异具有统计学意义,提示过表达miR-20a可以诱导肝癌细胞发生辐射抵抗。3.沉默miR-20a降低肝癌细胞辐射抵抗在内源性miR-20a表达相对高的肝癌细胞株QGY-7701 (t=-9.627, P=0.011)和HCCLM3 (t=-18.859, P=0.003)细胞中沉默miR-20a的表达后,细胞存活分数降低,辐射敏感性增强,差异具有统计学意义(tHCCLM3=5.606, PHCCLM3=0.005; tQGY-7701=4.942, PQGY-7701=0.008)。提示沉默细胞内源性miR-20a可以降低肝癌细胞辐射抵抗。4. Westernblot检测相关蛋白表达水平的变化H2AX是目前国内外研究细胞DNA损伤应激反应的热点之一。细胞在电离辐射或其他因素作用下直接诱导或是通过复制压力诱导形成的双链断裂(DSBs),在细胞辐射后6h内检测蛋白水平的表达,可以了解DNA双链断裂的情况,即DNA损伤情况。Western blot结果显示,稳定过表达miR-20a的肝癌细胞株Bel-7402和SMMC-7721,联合同等剂量放疗后,与空白对照组及LV-con组相比,γ-H2AX表达水平降低,提示miR-20a有助于DNA损伤的修复。反之,沉默miR-20a后,γ-H2AX表达水平升高,提示DNA损伤修复能力减弱。过表达miR-20a后,在同等剂量照射下凋亡相关蛋白active-caspase-3表达水平下降,Bcl-2表达水平升高,提示抗凋亡能力增强。沉默miR-20a后,active-caspase-3表达水平升高,Bcl-2表达水平下降,提示细胞凋亡作用增强,辐射敏感性增强。以上结果提示过表达miR-20a可以诱导肝癌细胞发生辐射抵抗。反之,沉默miR-20a后细胞辐射敏感性增强。此外,我们还发现,过表达miR-20a后,与对照及空白组相比,PTEN表达水平下降,而p-AKT表达水平升高,反之,在沉默内源性miR-20a后,PTEN表达水平升高,而p-AKT表达水平下降。三. MiR-20a通过靶向抑制PTEN激活PI3K/AKT通路诱导肝癌细胞辐射抵抗1. PTEN为miR-20a的靶基因荧光素酶报告系统结果显示,在转染野生型PTEN基因3’-UTR载体的实验组中, miR-20a mimics组与miR-con组相比,荧光素酶活性显著降低(tWT=-10.221, PWT=0.009);而miR-20a inhibitor组与anti-miRcon组相比,荧光素酶活性显著升高(tWT=15.119,PWT=0.004),差异均具有统计学意义。在转染突变型PTEN3’UTR突变载体的实验组中,miR-20a组与miR-con组相比荧光素酶活性无显著差异(tMUT=-0.104, PMUT=0.926); miR-20a inhibitor与anti-miRcon组相比,荧光素酶活性也无显著差异(tMUT=1.192,PMUT=0.355,)。以上证明miR-20a能够作用于PTEN基因3’UTR区,从而抑制了荧光素酶的活性,提示PTEN为miR-20a的直接靶基因。2. miR-20a负性调控PTEN的表达qRT-PCR结果显示,在肝癌细胞Bel-7402及SMMC-7721中脂质体介导转染miR-20a mimics后,与scramble negative control组(miR-con)相比,PTEN表达水平下调(tBel-7402-miR-20Q mimics=-15.371, PBel-7402-miR-20a mimics=0.004; tSMMC-7721-miR-20a mimics=-14.340. PSMMC-7721-miR-20a mimics=0.005),差异具有统计学意义。肝癌细胞中转染miR-20a inhibitor后,与对照组anti-miRcon相比,PTEN表达水平上调(tBel-7402-antimiR-20a=11.498, PBel-7402-antimiR-20a=0.007; tSMMC-7721-antimiR-20a= PSMMC-7721-antimiR-20a=0.014),差异具有统计学意义。Western blot结果显示,在肝癌细胞株Bel-7402及SMMC-7721过表达miR-20a后,PTEN表达水平下降。反之,在肝癌细胞株QGY-7701及HCCLM3中沉默miR-20a后PTEN表达水平升高。以上结果进一步佐证了PTEN为miR-20a直接作用的下游靶基因。3.干扰PTEN增强肝癌细胞辐射抵抗慢病毒转染技术建立稳定干扰PTEN肝癌细胞株,细胞辐射及平板克隆形成实验结果发现,在肝癌细胞Bel-7402和SMMC-7721沉默PTEN后,辐射后细胞存活分数升高(tBel-7402=-8.997, PBel-7402=0.001; tSMMC-7721=5.894, PSMMC-7721=0.004),差异有统计学意义,提示细胞辐射抵抗能力增强。Westernblot结果显示,干扰PTEN联合放疗后,与对照组及空白组相比,γ-H2AX和活性的caspase-3表达水平降低,Bcl-2表达水平升高,且p-AKT表达升高。4.过表达PTEN降低肝癌细胞辐射抵抗将过表达PTEN的质粒应用脂质体介导的方法转入肝癌细胞HCCLM3及QGY-7701中,结果提示PTEN过表达后,肝癌细胞辐射后存活分数降低(tHCCLM3=5.147, PHCCLM3=0.007; tQGY-7701=4.021, PQGY-7701=0.016),差异有统计学意义,提示辐射抵抗能力减弱。Westernblot结果显示过表达PTEN后,与空白对照组及control组相比,γ-H2AX和caspase-3表达水平升高,Bcl-2表达水平降低。同时发现过表达PTEN后p-AKT表达下降。5. PTEN为miR-20a诱导肝癌辐射抵抗的功能性靶基因在稳定过表达niR-20a的肝癌细胞中转染过表达质粒pCDNA3.1-PTEN,恢复PTEN的表达。细胞辐射和平板克隆实验结果显示,与对照组相比,细胞克隆形成率及存活分数降低,细胞辐射抵抗能力减弱,提示PTEN可以至少部分逆转miR-20a引起的肝癌辐射抵抗(PBel-7402<0.001; PSMMC-7721<0.001)。 Western blot实验结果发现,PTEN可以逆转过表达miR-20a引起的凋亡相关基因的及p-AKT的表达。以上结果表示PTEN为miR-20a诱导肝癌辐射抵抗的一个功能性靶基因。6. MiR-20a通过靶向PTEN从而激活PI3K/AKT通路诱导肝癌辐射抵抗前面我们已经证实miR-20a可以通过靶向PTEN诱导肝癌细胞发生辐射抵抗,而PTEN又是PI3K的重要抑制性调节分子,我们设想推测miR-20a是否通过抑制PTEN的表达从而激活了PI3K/AKT通路最终诱导肝癌细胞辐射抵抗。为了进一步证实我们的推测,应用PI3K/AKT通路抑制剂LY294002阻断该通路的激活,观察肝癌细胞辐射敏感性的变化。实验结果显示,加入PI3K/AKT通路抑制剂LY294002后,与未加入组对比,细胞存活分数降低,证明LY294002至少可以部分逆转miR-20a引起的肝癌细胞辐射抵抗(PBel-7402<0.001; Psmmc-7721<0.001), miR-20a通过抑制PTEN进一步激活PI3K/AKT通路诱导肝癌细胞辐射抵抗。裸鼠体内实验结果显示,未放疗组LV-con与LV-miR-20a肿瘤大小差异无统计学意义(P>0.05)。而放疗组LV-con+IR与LV-miR-20a+IR相比,肿瘤体积较大,且差异具有统计学意义(P<0.001)。未放疗组LV-con与LV-miR-20a肿瘤体积五倍增长需要的天数无明显差异,而放疗组LV-miR-20a与LV-con相比,需要的天数减少,差异具有统计学意义(*P<0.05), Westernblot结果显示,放疗组LV-miR-20a+IR与LV-con+IR相比,PTEN表达水平明显降低,而p-AKT表达水平升高。以上体内外实验结果提示,miR-20a通过靶向抑制PTEN从而激活PI3K/AKT信号通路诱导肝癌辐射抵抗。结论：1.miR-20a在肝癌细胞株和组织标本中表达升高。2.PTEN在肝癌细胞株和组织标本中表达降低,且与miR-20a表达呈负相关。3.过表达miR-20a增强肝癌细胞辐射抵抗,反之,抑制miR-20a辐射抵抗减弱。4.PTEN为miR-20a的靶基因。5.干扰PTEN增强肝癌细胞辐射抵抗,反之,过表达PTEN降低辐射抵抗。6. PTEN是miR-20a诱导肝癌细胞辐射抵抗的一个功能性靶基因。7.miR-20a通过靶向抑制PTEN从而激活PI3K/AKT信号通路诱导肝癌细胞辐射抵抗。8.裸鼠实验证实miR-20a体内可以诱导肝癌辐射抵抗。