研究背景:卵巢癌是妇科常见的生殖道恶性肿瘤,死亡率居妇科肿瘤之首,严重威胁了广大女性的健康和生命。疾病的早期诊断困难以及复发、转移所致的治疗手段缺乏,是卵巢癌死亡率居高不下的主要原因。卵巢透明细胞肿瘤是上皮性卵巢肿瘤中的一种,绝大部分为恶性肿瘤,约占卵巢上皮性癌的5%,在东方女性中较西方更为常见。卵巢透明细胞癌虽较少见,但因具有对化疗不敏感、易耐药、早期复发、预后差的特点,引起了妇科肿瘤研究者的广泛关注。赖氨酰氧化酶(Lysyl oxidase,LOX)是细胞外基质(extracellular matrix,ECM)中催化胶原与弹性蛋白聚合的关键酶。研究表明LOX可调节细胞移动,参与基因调节、细胞分化、生长调控及促使正常细胞发生恶性转化等。近期研究发现肿瘤的发生、发展,细胞的分化、生长控制、黏附性、活性、恶性转化及侵袭性等均与细胞外基质中LOX的异常表达密切相关。目前认为LOX可能具有双重作用,既是肿瘤抑制因子,同时也很可能是肿瘤转移的促进因子。之前很多文献报道LOX在不同类型的肿瘤细胞系和原发性肿瘤中的表达出现紊乱,令人感兴趣的是,LOX在不同类型肿瘤中表达改变也不相同,在病理状态下LOX的表达出现上调或下调的情况均有报道。然而,LOX在卵巢癌中,尤其是卵巢透明细胞癌中的表达及生物学功能仍不明确。microRNA是一类内源性、非编码、单链小分子RNA,通过促进靶基因mRNA降解和(或)抑制其翻译,在转录后水平发挥调控基因表达的作用。microRNA的异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关,其异常表达导致肿瘤细胞无限增殖、凋亡抑制,并促进肿瘤的侵袭、转移,同时也是肿瘤细胞间质重塑和肿瘤血管生成的重要因素。研究表明microRNA具有很好的组织特异性,并且其表达在肿瘤发生、发展的各个阶段也具有差异性,这提示我们可以使用microRNA作为肿瘤早期诊断及病情监测的标志物。近年来,关于卵巢癌中microRNA功能的研究越来越多。结论表明,多种microRNA参与卵巢癌的发生、发展。有些是作为原癌基因发挥促进肿瘤细胞增殖、侵袭以及转移的作用,而有些则作为抑癌基因发挥抑制肿瘤发生、发展的作用。通过生物信息学预测,我们发现miR-29b可能是能够转录后调控LOX的microRNA。现有研究表明,miR-29b的表达在乳腺癌,肝癌,前列腺癌等多种肿瘤中均呈不同程度下调,并且参与了结肠腺瘤向结肠癌发展的早期过程,提示miR-29b在肿瘤的发生、发展过程中可能作为抑癌因子发挥作用。另有研究发现,miR-29家族与细胞凋亡关系密切,通过诱导细胞凋亡促进乳腺癌和结肠癌的发生、发展,也可在胆管癌细胞中通过抑制Mcl-1的表达增加细胞对TRAIL的凋亡敏感性,从而促进肿瘤的发生、发展。目前miR-29的研究已涉及多种肿瘤,microRNA表达谱显示,miR-29在卵巢癌中失调表达,但其发挥生物学功能的具体分子生物学机制仍不清楚。综上所述,研究LOX在卵巢透明细胞癌中的功能,筛选出在卵巢透明细胞癌中能够将LOX作为靶基因的microRNA,并探究其发挥生物学功能的机制,将为LOX有可能成为卵巢透明细胞癌治疗和预防转移的新靶点提供理论基础。研究目的:(1)检测卵巢透明细胞癌组织、癌旁组织以及多种卵巢癌的细胞系中LOX的表达。(2)检测过表达LOX对卵巢透明细胞癌细胞增殖能力和侵袭能力的影响,确定LOX的生物学功能。(3)筛选并证实在卵巢透明细胞癌中能够调控LOX的microRNA,并分析其与LOX表达量之间的关系。(4)检测miR-29b异常表达对卵巢透明细胞癌细胞增殖能力和侵袭能力的影响。研究方法:1.收集27例外科切除手术所得的卵巢透明细胞癌组织及癌旁组织标本,使用免疫组化法对癌组织标本及癌旁组织标本中LOX的蛋白表达水平进行检测,统计分析不同组织中LOX的阳性表达率,进行分析。此外,体外培养多种卵巢癌细胞系,例如人卵巢透明细胞癌细胞ES-2,人卵巢上皮细胞癌细胞OV-1063,人卵巢腺癌细胞SKOV3和人卵巢腺癌细胞OVCAR-3,以正常卵巢上皮细胞为阴性对照,使用Western blot法检测细胞中LOX的蛋白表达水平。2.将LOX的编码区构建到pcDNA3骨架质粒上,建立pcDNA3-LOX过表达质粒,并将该过表达质粒转染至ES-2细胞中,用Western blot法验证过表达效率。瞬时转染LOX过表达质粒24小时(24 h)、48小时(48 h)和72小时(72h)后,使用CCK-8法检测过表达LOX对细胞增殖能力的影响。瞬时转染LOX过表达质粒48 h后,使用Transwell法检测过表达LOX对细胞侵袭能力的影响。3.通过生物信息学网站Targetscan寻找并筛选可能的microRNA。使用实时定量PCR法对ES-2,OV-1063,SKOV3和OVCAR-3几种卵巢癌细胞中miR-29b的表达谱进行检测,并与LOX的表达谱进行比较,进一步明确miR-29b与LOX表达之间的关系。将LOX基因m RNA 3’UTR区构建到pMIR-REPORTTM质粒上形成Luc-LOX3’UTRWT质粒,进行荧光素酶报告实验,并将Luc-LOX3’UTR WT质粒上与miR-29b互补配对的位点进行突变,成为Luc-LOX 3’UTR Mut质粒,与正常的Luc-LOX 3’UTR质粒组进行比较,明确LOX是否为miR-29b的靶基因。使用Western blot法检测改变miR-29b的表达水平是否能够影响内源性LOX蛋白白的表达水平。4.将miR-29b激动剂Mimics、miR-29b抑制剂Inhibitor以及阴性对照Scramble转染至ES-2细胞中,并用实时定量PCR法验证过表达和敲低效率。使用CCK-8法检测Mimics组、Inhibitor组及Scramble组中细胞增殖能力的改变。使用Transwell法检测Mimics组、Inhibitor组及Scramble组中细胞侵袭能力的改变。结果:1.检测卵巢透明细胞癌、癌旁组织及多种卵巢癌细胞系中LOX的表达:1.1免疫组化检测卵巢透明细胞癌、癌旁组织中LOX的表达:卵巢透明细胞癌癌旁组织中可以检测到明显的LOX表达,而卵巢透明细胞癌组织中均未检测到强表达。LOX阳性产物为棕黄色颗粒,27例卵巢透明细胞癌癌旁组织中表达阳性23例(85.2%),表达阴性为4例(14.8%)。而在卵巢透明细胞癌组织中表达阳性3例(11.1%),表达阴性为23例(88.9%)。1.2 Western blot法检测多种卵巢癌细胞系中LOX的表达:在正常卵巢上皮细胞中,LOX蛋白呈现较高的表达水平。在人卵巢透明细胞癌细胞ES-2,人卵巢上皮细胞癌细胞OV-1063,人卵巢腺癌细胞SKOV3和人卵巢腺癌细胞OVCAR-3中LOX蛋白表达水平则明显降低。2.LOX过表达质粒转染卵巢癌细胞后细胞增殖、侵袭能力的变化:转染LOX过表达质粒24小时(24 h)、48小时(48 h)和72小时(72 h)后,ES-2细胞增殖能力受到明显抑制。转染LOX过表达质粒48小时后,ES-2细胞的侵袭能力受到明显抑制。差异有统计学意义,p<0.05。3.荧光素酶报告系统及Western blot验证miR-29b对LOX表达的调控:ES-2中miR-29b出现异常高表达,而OV-1063、SKOV3和OVCAR-3中miR-29b 未见有异常表达。将 Luc-LOX 3’ UTR WT 与 Luc-LOX 3’ UTR Mut分别转染至ES-2和SKOV3中,miR-29b表达较高的ES-2细胞中,Mut组荧光素酶活性较WT组明显升高;而在miR-29b表达较低的SKOV3细胞中,Mut组和WT组荧光素酶活性大致相等。将Luc-LOX 3 ’ UTR WT与Luc-LOX 3 ’ UTR Mut分别转染至Hela细胞中,再同时过表达miR-29b,则Luc-LOX 3 ’ UTR WT组中过表达miR-29b能够有效地降低荧光素酶活性,而Luc-LOX 3’ UTR Mut组中则无明显改变。差异有统计学意义,p<0.05。4.miR-29b过表达及敲除实验检测miR-29b对卵巢透明细胞癌细胞增殖、侵袭能力的影响:转染构建miR-29b过表达和敲低体系。CCK-8法结果显示,Mimics组细胞增殖能力与Scramble组相比并未见明显变化;而Inhibitor组中ES-2细胞的增殖能力受到明显抑制。Transwell法结果显示,Mimics组细胞侵袭能力与Scramble组相比并未见明显变化;而Inhibitor组中ES-2细胞的侵袭能力受到明显抑制。差异有统计学意义,p<0.05。结论:1.LOX蛋白水平在卵巢透明细胞癌组织标本和多种卵巢癌细胞系中表达明显下调。2.过表达LOX能够抑制卵巢透明细胞癌细胞的增殖和侵袭能力。3.LOX是miR-29b的靶基因,miR-29b能够转录后抑制LOX的蛋白表达水平。4.敲低内源性miR-29b表达能够抑制卵巢透明细胞癌细胞增殖和侵袭能力,效应与过表达LOX类似。