锰在自然界中含量丰富,是生物体必需的微量元素之一。然而锰浓度过高,将造成生态环境的污染和机体内锰平衡被破坏,发生中毒,影响动物和人体健康。锰氧化细菌主要在淡水、海洋和土壤等环境中存在,其作用主要是将Mn(Ⅱ)氧化成Mn(Ⅲ)或者Mn(Ⅳ),这一生物氧化过程较非生物氧化过程具有快速的特点,是环境中锰氧化物形成的主要原因。国内外主要对少数种类的海洋细菌的锰氧化机制进行了研究,土壤锰氧化细菌的相关研究知之甚少。沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)菌株S7是本实验室从锰冶炼区土壤分离得到的一株耐锰能力达到2200 mg/L的细菌。通过LBB试剂完成固体和液体氧化测定,同时将无锰培养和加锰培养的细菌做电子扫描电镜,观察到加锰培养的细菌表面有明显氧化物附着,从而推断该菌株确实具有锰氧化活性。在此基础上,选择使用转录组学(RNA-seq)技术比较在锰胁迫浓度为0 mg/L和250 mg/L处理下,沙福芽孢在对数生长期和稳定生长期的差异基因表达情况,培养时间分别为8 h、12 h、16 h和24 h共8个转录组。期望从中筛选出耐锰相关基因,为细菌锰氧化机制研究奠定理论基础。得到的结果如下:1.沙福芽孢杆菌对锰的氧化活性为7.75μmol/(L.d)。2.测序所得数据经STAR比对、featurecounts计数,最后用DESeq2、edgeR两个软件分析基因的差异表达量变化,对数生长期共得到1199个差异显著基因,502个上调基因,538个下调基因。稳定生长期得到1462个差异显著基因,760个上调基因,702个下调基因。两个时期共有的差异表达基因有518个。与对照组相比,对数生长期的差异基因主要富集在鞭毛合成、TCA循环、氧化磷酸化通路;而稳定生长期的差异基因则主要富集在代谢、氨基酸的生物合成、抗生素的生物合成,以及富集度较大的非核糖体肽结构、缬氨酸亮氨酸与异亮氨酸生物合成、烟酸酯和烟酰胺代谢、链霉素的生物合成和C5-支链二元酸代谢等通路通路。这些通路可能在细菌不同生长时期调控以应对锰胁迫。3.从两组差异基因中随机挑取16个基因,其中包括:6个氨基酸代谢相关基因、5个氧化磷酸化相关基因、1个鞭毛基因、1个糖酵解相关基因、1个双组分系统相关基因、1个锰氧化酶基因和1个铜转运蛋白基因。对16个基因在不同锰胁迫浓度、不同培养时间做荧光定量PCR,试验数据表明与转录组分析结果相符,分析结果真实可靠。16个基因的表达无相同模式,在不同锰胁迫条件下,基因的表达量具有时序性变化。氨基酸代谢相关基因中,除了gene3997的表达模式趋于平缓,其它基因在4-8 h表达量最大,16 h后呈逐渐上升趋势;氧化磷酸化基因则在前4 h基本保持稳定的低表达,在8 h达到峰值,8-16 h有急剧下降变化。高浓度锰处理时的基因表达量绝大部分高于低浓度锰处理。大部分基因都在8h达到峰值,呈双峰表达模式。4.利用同源重组单交换的方法对gene601进行敲除,获得的gene601缺陷菌株的锰氧化能力较野生菌株下降了。证明gene601是沙福芽孢杆菌的锰氧化关键基因。