论文部分内容阅读
目的1.通过临床研究,分析2型糖尿病肾病（DKD）住院患者的临床诊治特点,探讨血压昼夜节律与DKD肾损伤的相关性,以及黄蜀葵花对DKD的临床疗效。2.基于网络药理学方法,探讨黄蜀葵花治疗DKD可能的作用机制。3.通过实验研究,进一步验证黄蜀葵花对DKD的治疗作用及机制,探讨黄葵素（TFA）对2型糖尿病db/db小鼠肾组织昼夜节律基因及HIF-1α、VEGF表达的影响。方法1.临床研究:（1）回顾性分析2019年～2020年期间于南京中医药大学附属医院内分泌科住院治疗的2型糖尿病肾病（DKD）患者的临床资料,探讨DKD住院患者的临床诊治特点。（2）以住院期间行24小时动态血压监测（ABPM）的DKD患者为研究对象,分析其血压控制情况及血压昼夜节律,进一步根据血压昼夜节律、白蛋白尿（UACR）分期、肾小球滤过率（GFR）分期进行分组,比较各组的临床生化特征及ABPM参数,采用Spearman相关检验分析血压昼夜节律与肾功能指标的相关性,多分类logistic回归分析DKD患者肾损伤可能的影响因素。（3）以住院期间使用黄蜀葵花制剂治疗的DKD患者为研究对象,比较不同剂量的黄蜀葵花治疗后DKD患者的肾功能及尿蛋白水平变化。2.网络药理学:通过中药系统药理学数据库（TCMSP）及文献检索筛选出黄蜀葵花的有效成分,利用SwissTargetPrediction平台预测其作用靶点,通过TTD、Drugbank、DisGeNET数据库获得与DKD相关靶点,将二者进行映射从而获得潜在治疗靶点。使用Cytoscape软件构建有效成分-靶点网络、蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络,对网络进行拓扑分析筛选关键靶点,并利用ClueGO插件进行GO和Reactome通路富集分析。3.实验研究:以自发性2型糖尿病db/db小鼠为DKD模型,随机分为:糖尿病肾病组（DKD组）、低剂量黄葵素组（LD-TFA组,100mg/kg·d）、高剂量黄葵素组（HD-TFA,200mg/kg·d）、REV-ERB 激动剂干预组（REV-ERB 组,SR9009,100mg/kg）,以 db/m 小鼠为正常对照（Control组）。黄葵素溶解于双蒸水灌胃给药,每日一次,对照组、DKD组予等体积双蒸水灌胃;REV-ERB激动剂SR9009通过腹腔注射给药,每周一次,各组均干预8周。测定各组小鼠体重、摄食量、血糖、血肌酐（Scr）、尿素（BUN）、胱抑素C（CysC）及24小时尿蛋白定量（UTP）水平,HE染色观察肾组织形态结构,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测肾组织昼夜节律基因Bmal1、Clock及HIF-1α、VEGF mRNA表达水平。结果1.临床研究:（1）共纳入DKD住院患者685例,其中男性占多数（67.4%）,平均年龄（60.96±13.37）岁,DM 病程 13.0（7.0,20.0）年,平均 BMI（25.46±3.79）kg/m2;43.4%合并 DR,71.4%合并DPN,72.3%合并LEAD,1.6%合并DF,1.3%合并糖尿病急性并发症;合并高血压病、脑卒中、冠心病、脂肪肝、骨质疏松滑质减少、甲状腺疾病的比例分别为75.3%、40.6%、20.0%、43.8%、29.5%、29.2%,合并感染的比例为13.6%,以尿路感染、肺部感染、急性上呼吸道感染最常见;平均HbA1c（8.80±2.28）%,血肌酐水平82.60（62.90,124.30）μmol/L,胱抑素C水平 1.27（0.95,1.84）mg/L,UACR 水平 302.0（71.0,1410.0）mg/g,UTP 水平 433.5（156.5,1816.3）mg/24h;尿蛋白电泳结果显示:以尿白蛋白为主（98.50%）,含少量转铁蛋白（0.70%）及IgG、IgA（0.60%）。肾脏超声结果示:平均左肾长径（10.71±1.15）cm,宽径（5.29±0.64）cm,厚径（4.99±0.66）cm,右肾长径（10.61±1.26）cm,宽径（5.10±0.66）cm,厚径（4.82±0.65）cm。西医基础治疗包括降糖、降压、调脂等,其中口服降糖药使用率为88.2%,使用比例较高的为:DPP4i、α糖苷酶抑制剂、SGLT2i、二甲双胍,胰岛素使用率为75.0%,GLP-1RA使用率为18.5%;降压药使用率为73.6%,使用比例从高到低依次为:钙通道阻滞剂、ACEI/ARB类、β受体阻滞剂、利尿剂、α受体阻滞剂。中药方剂使用率为92.4%,黄蜀葵花制剂使用率为82.6%,其中甲花片、黄葵胶囊、芪葵颗粒、黄蜀葵花饮片使用率分别为35.8%、33.6%、52.3%、28.8%。（2）①血压控制情况:共纳入470例DKD住院患者,其中392例（83.4%）合并诊室高血压,仅41.6%血压控制达标,血压未控制达标者表现为持续性高血压（31.4%）、白天高血压（2.0%）、夜间高血压（23.7%）、白大衣高血压（1.3%）;78例（16.6%）诊室血压正常的患者中,有35.9%为隐蔽性高血压。②血压昼夜节律:在470例DKD患者中,血压昼夜节律正常（杓型）者有57例（12.1%）,血压昼夜节律异常者有413例（87.9%）,包括血压昼夜节律减弱（非杓型）者213例（45.3%）,血压昼夜节律消失（反杓型）者200例（42.6%）;在诊室血压升高的DKD患者中,杓型、非杓型、反杓型的比例分别为11.5%、44.6%、43.9%;在诊室血压正常的DKD患者中,杓型、非杓型、反杓型的比例分别为15.4%、48.7%、35.9%。③分组比较:随着血压昼夜节律异常程度增加,夜间SBP、夜间DBP、HbA1c、BUN、Scr、CysC、UACR、UTP水平逐渐升高,白天DBP、eGFR水平逐渐降低（P＜0.05）;随着UACR分期增加,血压昼夜节律异常者所占比例随之增加,诊室SBP、24小时SBP、白天SBP、夜间SBP、夜间DBP、TC、SUA、BUN、Scr水平逐渐升高,eGFR水平逐渐降低（P均＜0.05）;随着GFR分期增加,24小时SBP、白天SBP、夜间SBP水平、TC、SUA、BUN、Scr、CysC、UACR、UTP 水平逐渐升高,诊室 DBP、24 小时 DBP、白天DBP、白天心率水平逐渐降低（P均＜0.05）。④Spearman相关分析显示,血压昼夜节律异常程度与UACR、BUN、Scr、CysC水平呈正相关,与eGFR水平呈负相关（P均＜0.05）。⑤多分类logistic回归分析显示,血压昼夜节律消失可能是DKD肾损伤的危险因素（UACR 分期:OR=1.88,95%CI 为 1.02～3.47;GFR 分期:OR=1.86,95%CI为 1.04～3.35）。（3）共纳入240例DKD住院患者,黄蜀葵花制剂治疗后患者的UACR水平较治疗前明显下降,并且黄蜀葵花高剂量组UACR下降程度大于黄蜀葵花低剂量组,差异具有统计学意义（P＜0.05）;治疗前后患者的血肌酐水平无明显改变（P＞0.05）。2.网络药理学:共筛选得到黄蜀葵花13个有效成分及155个预测靶点,与疾病映射后得到45个潜在的治疗靶点。黄蜀葵花有效成分主要作用于HIF-1α、VEGF、TNF、AKT1、MMP等蛋白,调控炎症、氧化应激、昼夜节律、HIF-1 α/VEGF等信号通路,发挥治疗DKD作用。3.实验研究:（1）体重、摄食量:实验过程中,db/db小鼠的体重、平均摄食量明显高于同时间点的db/m小鼠,而不同组的db/db小鼠体重、平均摄食量无明显差异。（2）血糖:与对照组比较,DKD组小鼠血糖水平升高（P＜0.05）;不同剂量的黄葵素干预后,db/db小鼠血糖水平无明显改变（P＞0.05）;SR9009干预后,db/db小鼠血糖水平降低（P＜0.05）。（3）肾功能:与对照组比较,DKD组小鼠血肌酐水平明显升高（P＜0.05）;不同剂量的黄葵素及SR9009干预后,db/db小鼠血肌酐水平呈下降趋势,但未达统计学差异（P＞0.05）。（4）尿蛋白:与对照组比较,DKD组小鼠尿蛋白水平显著升高（P＜0.05）;不同剂量黄葵素及SR9009干预后,db/db小鼠的尿蛋白水平显著下降,且HD-TFA组较LD-TFA组下降更明显（P＜0.05）。（5）HE染色:与对照组比较,DKD组db/db小鼠肾小球肥大,基底膜增厚,系膜增生,肾小管上皮细胞变性。不同剂量的黄葵素干预后,db/db小鼠肾脏病理改变呈不同程度的减轻。（6）核心昼夜节律基因表达:与对照组比较,DKD组小鼠肾组织Bmal1 mRNA表达水平升高,黄葵素及SR9009干预后,db/db小鼠Bmal1 mRNA表达水平降低（P＜0.05）;各组小鼠肾组织Clock mRNA表达水平无差异（P＞0.05）。（7）HIF-1α、VEGF表达:与对照组比较,DKD组小鼠肾组织HIF-1α、VEGF mRNA表达水平增加,黄葵素干预后HIF-1α、VEGF mRNA表达水平降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论1.血压昼夜节律异常在DKD患者中普通存在,并且与DKD肾损伤相关。2.临床研究及实验研究表明,黄蜀葵花能改善DKD肾损伤,降低尿蛋白水平,且疗效与剂量呈正相关。3.网络药理学研究和实验研究结果相呼应,表明黄蜀葵花可能通过调控昼夜节律通路、HIF-1α/VEGF信号通路,发挥肾保护作用。