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目的：全世界约有3亿人感染乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV），中国约占1/3。中国作为乙型肝炎的高流行区， HBV表面抗原携带人数占全球总感染人数的近50%[1]。此外，患慢性肝炎的病人中约有80%以上为慢性乙型肝炎患者，而HBV慢性感染人群罹患原发性肝细胞癌的相对危险性至少增加300倍[2]。HBV属嗜肝DNA病毒科（Hepadnaviridae）,基因组长约3.2kb,为部分双链环状DNA。其基因组共有四个开放阅读框架（open reading frame,ORF），分别称为S、C、P、X区。S区可分为S基因区和前S基因区两部分。S基因编码HBsAg,它是病毒的包膜蛋白，介导病毒感染进入细胞内。前S基因位于S基因读码框架之前，分别编码Pre S1和Pre S2蛋白。C区基因包括前C基因和C基因，分别编码HBe和HBc蛋白，HBc蛋白参与病毒颗粒的组装，在病毒的生活周期中发挥了重要作用。P区最长，约占基因组75%以上，编码病毒DNA多聚酶。X区编码154个氨基酸的X蛋白，其对病毒复制至关重要，并且生物学功能活跃，与肝癌的发生发展密切相关。HBx是HBV编码的一种重要的病毒调控因子，可反式激活多种宿主和病毒基因转录，大量研究证实它在基因调控、细胞信号转导、细胞增殖和转化等方面具有重要作用。研究表明HBx在促进原发性肝癌的发生及促进肿瘤细胞的侵袭及转移方面发挥重要作用。Wnt信号通路是广泛存在于真核生物中的一条高度保守的信号通路，在胚胎的发育过程中起到重要的作用。目前发现Wnt信号通路与多种肿瘤的发生有关，如肝癌、肺癌、结肠癌、黑色素瘤。有研究发现在50-83%的肝癌中可以发现β-catenin的异常活化，其中因CTNNB1（β-catenin）基因突变等引起β-catenin的异常活化仅占20%左右，HCC组织标本中AXIN1，AXIN2基因的突变较少见，结肠腺瘤样息肉基因（Adenomatous Polyposis Coli，APC）的失活突变至今未在HCC中发现，这也预示了在HCC发生过程中，Wnt/β-catenin信号通路其他分子的异常活化或者拮抗分子的失活可能参与了该信号通路的异常活化。Wnt/β-catenin信号通路拮抗因子包括DKK家族和sFRP家族。sFRP家族含有5个分泌型的糖蛋白家族成员（sFRP1,2,3,4,5），sFRP约有300个氨基酸残基，包括一个同源的N2末端CRD和一个C2末端。sFRP结构上与Wnt受体极为相似，具有同源的配体抑制区，但缺少7个编码跨膜部分的结构域。 sFRP具有相同的半胱氨酸富集结构域，它们通过竞争性结合Fzd受体而抑制Wnt通路的活化。有研究表明，SFRPs基因的高甲基化修饰与多种肿瘤的发生密切相关。在结肠癌、食管癌、胃癌、膀胱癌、肝癌等中都可发现SFRPs基因启动子区超甲基化修饰，而使其表达受到抑制。有研究发现，乙型肝炎病毒X蛋白可通过激活Wnt/β-catenin信号通路，从而导致细胞异常增殖，参与原发性肝癌（HCC）的发生，但具体机制不明。本研究拟在细胞水平明确HBx能否在表观修饰水平调控sFRPs基因启动子区的甲基化状态，并且深入分析HBx表观调控sFRPs的分子机制。方法：通过RT-PCR检测稳定表达HBV的HepG2.2.15、HepG2H7细胞,以及采用腺病毒感染过表达HBx的HepG2细胞中sFRPs的表达；DAC处理后观察上述细胞sFRPs表达变化。进一步采用甲基化特异PCR(MSP)检测上述细胞中sFRP1和sFRP5启动子区甲基化状态，采用亚重硫酸盐DNA测序检测HBx是否可以促进sFRP1和sFRP5启动子区高甲基化修饰。通过染色质免疫共沉淀（ChIP）技术研究sFRP1和sFRP5启动子区重要的甲基化修饰酶Dnmt1、Dnmt3a以及组蛋白乙酰化修饰酶HDAC1，P300等蛋白的结合情况，探讨HBx蛋白对sFRPs基因表观沉默的分子机制。结果：我们首先在HBV稳定转染的HepG2.2.15以及HepG2H7细胞中观察到Wnt信号抑制分子sFRP1、sFRP5的表达较对照细胞明显下调，这一实验现象在HBx过表达的肝癌细胞系HepG2及Huh7中得到验证。进一步采用DAC对细胞进行去甲基化处理，上述基因的表达能部分回复，并且sFRP1、sFRP5基因表达的回复程度与DAC药物的浓度呈剂量依赖关系。甲基化特异PCR以及亚重硫酸盐测序实验均证实HBx可以诱导sFRP1、sFRP5基因启动子区高甲基化修饰。采用ChIP实验深入研究HBx表观修饰sFRP1和sFRP5基因的分子机制时发现：HBx可以募集甲基化修饰酶DNMT1、DNMT3A以及甲基化相关蛋白MBD1、MBD2结合于sFRP1启动子区，促进sFRP1启动子区CpG岛高甲基化，同时还抑制组蛋白H3乙酰化以及HAT(P300)结合于sFRP1启动子区，从而抑制sFRP1的表达。HBx还能招募DNMT3A、DNMT3B、MBD1、MECP2富集于sFRP5启动子区，对sFRP5的表达起表观调控作用。结论：乙型肝炎病毒X蛋白可招募甲基化转移酶DNMT1、DNMT3A及甲基化相关蛋白MBD1、MBD2富集于sFRP1、sFRP5启动子区，诱导其甲基化，致使sFRP1、sFRP5基因表达沉默。