论文部分内容阅读
目的:探讨应用RNA干扰(RNAi)技术沉默Ang2、Tie2基因使其在体外抑制血管生成的研究,为将来进一步进行抑制肿瘤血管生成的动物实验研究奠定基础,为肿瘤的基因治疗提供实验依据。方法:1、以Ang2、Tie2的mRNA已知序列为靶点,构建PSilencer 1.0-U6-siRNA- Ang2/Tie2-siRNA重组质粒各2条。2、pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒通过脂质体介导转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs),采用免疫细胞化学染色和RT-PCR检测各组HUVECs中Ang2和Tie2的mRNA及蛋白的表达状况。3、应用体外血管生成的三维培养模型研究pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒转染后的HUVECs在体外形成血管样结构的情况。结果:1、成功构建pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒各2条,并且应用限制性内切酶Hind III进行消化,证实重组质粒不能被消化;测序结果与设计的完全相符。2、pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒转染HUVECs后,免疫细胞化学染色和RT-PCR检测结果显示,Ang2及Tie2在蛋白和mRNA的表达水平均受到明显抑制(P<0.05),并且两个siRNA的2条重组质粒之间均无明显差别(P>0.05)。3、pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒转染后的HUVECs在体外三维培养模型中血管样结构形成的数量和长度均明显减少(P<0.05),表明血管生成受到明显抑制。结论:1、成功构建pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒。2、Ang2-siRNA、Tie2-siRNA在体外能够抑制HUVECs的Ang2和Tie2的蛋白及mRNA的表达,从而在体外抑制血管生成。