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结核病（Tuberculosis,TB）是全球第二大传染性死亡原因。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M.tb）是引起TB的主要致病菌,具有复杂的细胞壁结构和逃逸宿主免疫监视等特性。M.tb细胞壁的结构主要由肽聚糖（Peptidoglycan,PG）,聚阿拉伯半乳糖（Arabinogalactan,AG）和分支菌酸（Mycolic acid,MA）构成,其中富含脂质成分的分支菌酸广泛参与生物膜（Biofilm）的形成。生物膜是一种彼此粘附或附着于表面或液界面的基质,主要由自分泌的细胞外多聚物（Extracellular polymeric substances,EPS）组成,包括多糖、DNA、蛋白质等生物大分子。生物膜形成有助于细菌抵抗药物、营养缺乏等特定压力,是微生物在宿主中存活的主要方式。耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis.M.smeg）是M.tb的模式菌。具有相似的细胞表面结构,但其生长快速并且无致病性。分枝杆菌在致密的细胞壁周围可以形成生物膜,该结构在耐药性TB形成中发挥重要作用。最新研究发现,分枝杆菌中存在一种肽聚糖酰胺酶,被命名为Ami1（Ami1的基因在M.tb和M.smeg中分别是Rv3717和MSMEG6281）,其作用位点是肽聚糖结构中N-乙酰胞壁酰和L-丙氨酸之间的酰胺键。Ami1在维持分枝杆菌细胞分裂、细胞壁结构及致病性方面发挥重要作用。本实验室构建了耻垢分枝杆菌Ami1功能缺失菌株（M.sm-ΔM6281）和Ami1功能补偿菌株（ΔM6281::Rv3717）,并进行了蛋白组学分析。在前期结果基础上,本研究发现Ami1功能与脂肪酸代谢及细胞壁分支菌酸合成密切相关,并进一步影响分枝杆菌细胞壁渗透性和生物膜的形成,推测Ami1是分枝杆菌致病病因子。我们进一步通过分子克隆技术表达、纯化了结构突变的Ami1蛋白,研究确定Ami1蛋白的翻译后修饰方式及酰胺酶活性影响因素,为分枝杆菌与宿主相互作用研究奠定基础。目的:1.揭示Ami1功能缺失对细胞壁渗透性和生物膜形成的影响及分子机制。2.明确Ami1的功能位点、糖基化及磷酸化修饰方式,以及酶活性影响因素。方法:1.利用耻垢分枝杆菌,研究Ami1功能对细菌细胞生长及细胞结构和形态的影响。培养M.S（对照组）、M sm-ΔM6281（敲除组）以及Ami1功能补偿的ΔM6281::Rv3717菌株（补偿组）,通过生长曲线检测MSMGE6281基因功能对细菌生长的影响。利用电子显微镜技术（Electron microscopy）观察MSMEG6281基因敲除后对菌体细胞壁厚度变化及细菌长度的改变。2.研究Ami1功能对细菌细胞壁渗透性的影响。首先通过CFU计数,评价细菌细胞壁对化学物质（SDS和结晶紫）渗透性的抵抗能力;其次,通过药物最小抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentration,MIC）和药物敏感性（Antimicrobial susceptibility test,AST）的测定,检测细菌对药物（异烟肼,乙胺丁醇,氨苄青霉素）敏感性的变化。3.为了检测Ami1功能对细菌生物膜形成的影响。利用试管法培养,观察生物膜形态;结晶紫染色法半定量测定生物膜形成量;利用不同表面培养法检测生物膜形态的差异。为确定Ami1功能缺失影响生物膜形成的机制,首先通过抗酸染色的分析以确定Ami1功能缺失对细菌细胞壁完整性和细胞表面分支菌酸含量的影响;利用有机试剂提取了 M.S、M sm-ΔM6281菌体细胞壁的分支菌酸混合物;利用薄板层析（Thin layer chromatography,TLC）分离后,质谱法鉴定不同分支菌酸成分的结构变化。并利用the STRING database（version 10.5）分析脂肪酸分解代谢相关蛋白。进一步利用RT-PCR分析分支菌酸代谢相关基因的表达变化。4.结核分枝杆菌Ami1蛋白结构变化对酰胺酶活性的影响。首先利用大肠杆菌表达纯化的Ami1蛋白为对照,通过以胞壁酰二肽（Muramyl dipeptide,MDP）为底物,利用LC-ESI/MS方法定量检测了 Ami1,Rv3717-M,ΔRv3717蛋白的酰胺酶活性变化。5.鉴定Ami1蛋白在耻垢分枝杆菌表达系统中的翻译后修饰。为确定分枝杆菌系统中Ami1酰胺酶活性是否受翻译后修饰影响,本研究以E.coli.BL21（DE3）表达系统为对照,初步鉴定了耻垢分枝杆菌表达系统中Ami1蛋白是否可以被磷酸化和糖基化修饰。首先,通过生物信息学方法,评估Ami1蛋白的磷酸化修饰位点。其次,利用结核分枝杆菌磷酸化激酶（pKnB）建立体外磷酸化反应体系,通过抗P-Ser抗体（Abcam公司）,检测Ami 1蛋白的磷酸化程度。最后,利用碘酸雪夫染色（Periodic acid-Schiff stain,PAS）方法,检测了 Ami1蛋白是否被糖基化修饰。进一步利用抗甘露糖凝集素（Sigma公司）,以Western blot方法检测Ami1蛋白是否被甘露糖基化。结果:1.通过培养M.S、M sm-ΔM6281以及ΔM6281::Rv3717生长曲线的测定,我们发现MSMGE6281基因是耻垢分枝杆菌生长的非必需基因。在EM检测结果发现,Ami1功能失活后,细胞壁完整性被破坏,菌体细胞壁厚度减小及细菌长度增加。2.CFU计数结果表明,M sm-ΔM6281细菌克隆数量均具有统计学意义降低,提示细胞壁渗透性增加。MIC和AST测定结果表明,Msm-ΔM6281细菌对氨苄青霉素的药物敏感性增加,但对乙胺丁醇和和异烟肼的敏感性未见明显变化;同时,我们也发现,ΔM6281::Rv3717菌株对三种抗生素的MIC减小,对药物的敏感性增加。3.通过试管法观察生物膜形态表明,与M.S和ΔM6281::Rv3717比较,M.sm-ΔM6281菌液成膜的形态凌乱不规则。结晶紫定量染色结果表明,M.sm-ΔM6281细菌形成生物膜的速度明显减慢,且形成的生物膜的量也相对减少。EM结果表明,M.sm-ΔM6281菌体集聚较少,生物膜形成比例较低;M.S菌体能检测到较多的细胞外分泌物,形态各异,生物膜形成比例高;ΔM6281::Rv3717细菌可见大量细胞外分泌物的存在,菌体集聚明显,生物膜形成比例最高。4.抗酸染色结果显示,M.sm-ΔM6281菌体抗酸染色减弱,推测Ami1功能缺失影响了细胞壁完整性并引起分支菌酸含量下降。细胞壁分支菌酸混合物TLC分离结果表明,与M.S相比,M.sm-ΔM6281分支菌酸含量明显降低;但两组均可以分离出5种不同迁移率的分支菌酸成分,其中有3种成分的迁移率在两组之间发生变化;进一步将迁移率变化的这3类条带进行ESI-MS分析结果显示,M.S和ΔM6281::Rv3717中分支菌酸成分均出现m/z为484,512,540,568,584相差CH2CH2-基团的峰值,另外,ΔM6281::Rv3717出现m/z为1073的特异性峰值。因此,以上研究表明,Ami1功能缺失后,细胞壁分支菌酸的组成和含量发生变化,可能与分支菌酸代谢变化相关。5.The STRING分析表明,Ami1功能缺失后,脂肪酸代谢相关蛋白的差异表达。RT-PCR进一步鉴定表明:分支菌酸代谢相关基因MSMEG3151,MSMEG4325 和 MSMEG4328 的表达上调,MSMEG0131,MSMEG2446 和MSMEG3150表达下调。6.Ami1蛋白结构变化对酰胺酶活性的影响。通过分子克隆和蛋白质纯化技术,我们成功纯化了耻垢分枝杆菌表达的Rv3717-M和ΔRv3717蛋白纯化物。以利用E.coli BL21（DE3）系统进行表达纯化的Ami1蛋白为对照,通过定量LC/MS技术检测MDP底物的减少量来评估酰胺酶酶活性大小。检测结果表明,酶促反应15min,Ami1检测出明显的酰胺酶活性,MDP减少量达到21.72%;Rv3717-M蛋白也检测到酰胺酶活性,MDP减少量达到43.05%;而点突变蛋白ΔRv3717,未检测到底物MDP的减少。以上研究结果表明,Ami1酰胺酶活性与C末端缺失无关,但与64位丙氨酸突变密切相关。7.鉴定Ami1蛋白在耻垢分枝杆菌表达系统中的翻译后修饰。通过PAS染色初步鉴定了耻垢分枝杆菌表达系统中Rv3717-M和Δ Rv3717目的蛋白均发生糖基化修饰,但E.coli BL21（DE3）系统进行表达纯化的Ami1蛋白未见糖基化修饰。进一步利用抗甘露糖凝集素,特异性检测到ΔRv3717蛋白被甘露糖基化,但无法验证Rv3717-M的甘露糖基化。利用磷酸化激酶（pKnB）建立体外磷酸化反应,通过抗P-Ser抗体特异性鉴定Ami1蛋白中是否有Ser残基被磷酸化修饰,得出ΔRv3717蛋白发生体外磷酸化,而Rv3717-M蛋白并没有发生磷酸化修饰。结论:综上所述,Ami1蛋白功能与维持细菌的形态,细胞壁的完整性和渗透性方面发挥重要作用。确定Ami1蛋白参与分枝杆菌生物膜的形成,可能与分支菌酸代谢密切相关。Ami1蛋白具有酰胺酶活性的功能区主要位于N末端,其功能与个别氨基酸突变（A64V）密切相关。蛋白翻译后修饰研究表明,Ami1蛋白具有Ser磷酸化和甘露糖基化双重修饰,但蛋白翻译后修饰对酰胺酶活性的影响有待进一步研究。