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人口老龄化已经成为我国严峻的社会问题,而Klotho基因被认为是衰老抑制基因,与FGF-23具有共同受体,具有调节血钙、磷的作用,并有抗氧化作用。本研究主要观察滋阴补肾法对衰老大鼠模型骨-肾内分泌轴的影响。目的:基于Klotho(Kl)基因/FGF-23信号通路研究滋阴补肾法对衰老大鼠模型骨-肾内分泌轴的影响。方法:造模方法:选取健壮的Wistar雄性大鼠40只,体重(200±20)g,按照随机表分为正常组、模型组、中药滋阴补肾组和西药阳性对照(维生素E)组四个组,四组中的大鼠样本数量相等,均为10只,进行时长为1周的适应性喂养后,使用D-半乳糖诱导衰老法造模,将D-半乳糖25g溶解于0.9%氯化钠液500ml中,用500mg/kg腹腔注射剂量(0.01ml/g)给予大鼠腹腔注射,正常对照组腹腔注射等体积的0.9%氯化钠注射液(0.01ml/g),每周称量体重1次,依据末次称量的体重调整给药剂量,造模时间为8周。给药方法:在建模开始同时灌胃,空白对照组、模型组生理盐水体积的一样,一天1次。中药滋阴补肾组每日灌服剂量为3.24g/kg,给药容量为1ml/100g。灌胃西药阳性对照(维生素E)组0.027g/kg。每个星期一计算大鼠体重给药,最后根据体重调整药物剂量。检测指标:(1)血尿素氮(Bun)、血肌酐(Scr)、钙(Ca2+)磷(P3+)水平,取血前1天代谢笼收集24h尿,测尿肌酐(Ucr)并计算肌酐清除率(Ccr);(2)检测肾组织超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),一氧化氮(NO),一氧化氮合成酶(NOS)的水平;(3)观察大鼠的体重、饮食、毛发、活动力及有无死亡。检测方法:(1)采用酶联免疫吸附法检测血FGF-23(fibroblast growth factor-23)的水平;(2)Western Blot检测大鼠肾皮质klotho蛋白,股骨FGF-23蛋白水平;(3)采用Real-time PCR检测大鼠肾脏klotho RNA的表达;(4)观察肾脏的病理变化;(5)采用免疫荧光法检测FGF23的表达。统计学方法:实验数据采用SPSS18.0统计软件进行处理,结果用((?)±s)表示,组间比较采用单因素方差分析。结果:(1)正常对照组大鼠摄食正常,毛发光亮,浓密,皮肤弹性好活泼好动,不易捉取。D-半乳糖从腹腔注射后,造模对照组大鼠逐步出现毛色萎黄,无光泽,掉毛严重,大便稀溏,饮食明显削减,行动缓慢,反应和活动能力差,生殖器萎缩,与自然衰老大鼠的症状类似,提示D-半乳糖组大鼠出现明显衰老体征。当造模8w后,B组与A组相比,体重明显下降,有显著性差别(P<0.01),经过药物治疗后,C组和D组与B组比较,体重明显上升,但C组与D组之间相比无统计学意义(见表1)。(2)对各组大鼠用药后BUN、Scr、Ccr检测结果显示:B组跟A组相比,血BUN、Scr明显升高,;内生肌酐清除率显著降低(P<0.01)。经药物干预治疗后,C、D组与B组相比较,血BUN、Scr明显下降,Ccr明显上升(P<0.01)。而D组与C组之间相比较,血BUN、Scr与略有降低,Ccr略有升高,但两组之间无统计学意义(P>0.05)。(3)对各组大鼠用药后血Ca2+、P3+、ALP检测结果比较:B组与A组相比,ALP、P3+增加,Ca2+显著下降(P<0.01)。经过药物干预治疗后,C组、D组Ca2+、P3+、ALP与B组相比有显著性差异(P<0.01)。而C、D组比较比较无差别(P>0.05)。(4)检测各组大鼠外周血FGF-23的水平,结果显示:(1)D-半乳糖腹腔注射后,B组FGF-23水平有明显上升的趋势,与A组对比,有显著性差异(P<0.01)。(2)经过治疗后,C、D组的FGF-23的水平较B组相比明显下降,有统计学意义(P<0.01),但是C组和D组之间比较无明显差异性(P>0.05),两组与A组相比有统计学意义(P<0.05)。(5)对各组大鼠肾组织SOD活性测定,结果显示:(1)造模后,造模B组大鼠肾SOD的活力相比A组明显降低(P<0.01),各治疗组的指标大大调高,与之对比亦有差别(P<0.01),说明大鼠肾组织SOD活性随老化而下降,而各治疗组具有提高其活性的功用。(2)C组、D组能升高SOD活性,但与正常组比较,结果仍有所下降(P<0.05)。(6)对各组大鼠肾组织丙二醛含量的测定,结果显示:(1)造模后,造模组大鼠肾组织MDA的测定较正常组上升,有可比性(P<0.01),各治疗组的MDA含量明显下降,具有可比性(P<0.01,P<0.05),说明大鼠衰老以后,肾组织MDA含量显著升高,而各治疗组均有下调MDA的作用。(2)与A组比较,D组无统计学意义(P>0.05),而C组与A组相比较,具有可比性(P<0.05)。(7)对各组大鼠血清NO的检测,结果表明:(1)造模后,B组大鼠血NOS的测定明显升高,与A组比较有差异性(P<0.01),各治疗组的测定出现显著的下降情况,对比治疗前来看存在统计学意义(P<0.05),这就说明对大鼠进行诱导衰老操作后,大鼠血清中出现了更多的NOS,经过治疗后NOS的含量明显下降。(2)治疗组和正常组的对照存在显著性差异,二者具有统计学意义(P<0.05),说明利用D-半乳糖能够实现对大鼠的诱导衰老,并造成NOS在血清中含量的增加,各个治疗组的NOS均得到了不同程度的降低,但难以恢复到衰老前的水平。(8)通过完成大鼠股骨骨密度检测,结果显示B组较A组明显降低(P<0.05),C组与D组相比较无明显区别(P>0.05)。经过药物治疗后,C组和D组与B组相比骨密度明显升高(P<0.05)。(9)通过Western blot检测肾脏kl表达水平,结果表明A组高于B组(P<0.01),C组与D组kl蛋白的表达与B组相对比有显著的统计学意义(P<0.05)。(10)通过Western blot检测股骨FGF-23蛋白水平,结果发现股骨FGF-23蛋白表达水平B组明显高于A组(P<0.01)。经过药物治疗后,C组和D组与B组相比FGF-23蛋白水平明显下降(P<0.01)。(11)各组大鼠股骨FGF-23免疫荧光结果显示,各组大鼠股骨荧光所见红染为FGF-23阳性表达,B组FGF-23阳性表达较A组明显增强(P<0.05);C组、D组阳性表达较B组减轻(P<0.05)。以彩色图像展示其相对吸光度,B组较A组显明提高(P<0.05)。C组、D组与B组比较明显下降(P<0.05),D组与C组相比虽有下降但没有意义(P>0.05)。(12)运用荧光定量PCR计算大鼠肾皮质中的klothom RNA的表达,结果显示:A组肾皮质kl蛋白的表现显明高过B、C、D组,B组跟A组相比大大下降(P<0.01),C组与D组kl蛋白的表达与B组相比上抬(P<0.01),C组与D组之间相比无差异性(P>0.05)。(13)在滋阴补肾组大鼠肾组织的细胞形态均在一定程度上恢复的治疗效果,光镜下观察,与模型组相比有明显的变化;电镜下造模组肾小球基底膜具有变厚、萎缩的特点,系膜的基质发生增多,血管腔堵塞等症状;肾小球上皮细胞足突广泛融合发生变性,线粒体和内质网肿胀细胞腔,核收缩发生变化甚至核破裂;上皮下有电子致密物沉积,六味地黄丸组对细胞的超微结构改善较为明显。结论:肾虚是衰老之根本,其中以肾精(阴)亏虚为本,故治疗大法,当以滋补肾阴(精)为先。六味地黄丸为滋养补肾阴(精)的代表方,作用缓和,疗效确切。促进机体的抗氧化能力、同时维持肾脏组织细胞的正常形廓来实现;对肾组织的KL蛋白的表达具有调控作用,推测滋阴补肾法可能通过klotho/FGF-23信号通路作用于骨-肾内分泌轴以期有改善衰老的作用。