论文部分内容阅读
弓形虫病(Toxoplasmosis)是一种由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的世界性分布人畜共患寄生虫病,人和动物的感染率都很高,严重危害人类健康,对孕妇和免疫缺陷、免疫抑制患者的损害尤甚,并给世界各国的畜牧业造成巨大的经济损失。国内散养鸡群中的弓形虫病感染不容忽视,平均在30%左右。人类通过接触病鸡或食用未煮熟的鸡可感染弓形虫,因此加强对鸡弓形虫感染的检测,对防控弓形虫病及人类健康有着重要的公共卫生学意义。目前,对畜禽弓形虫感染的检测手段主要有病原学诊断、免疫学诊断和核酸检测技术三类。ELISA法具有灵敏性高、特异性高、重复性好等特点,且对检测设备要求不高,是一种优良的检测手段。市场上销售的检测鸡弓形虫抗体的ELISA试剂盒特异性差、抗体检出时间短,对感染后期的抗体无法检出。近些年在国内外,关于猪、牛、羊等家畜动物弓形虫感染及抗体检测技术的研究和报道较多,但对鸡等禽类弓形虫感染检测的研究较少。本实验室对GRA8全基因进行了克隆表达,并进行了Western blot和ELISA验证,表明GRA8是一种具有很好诊断价值的鸡弓形虫病诊断抗原,但由于GRA8基因被正确插入原核表达质粒中,原核重组表达质粒在大肠埃希菌中表达GRA8的水平低,所以本研究利用TMHMM、SignalP4.1和DNAstar等生物学软件进行了信号肽及疏水区预测,构建了切除信号肽及疏水区的截短型sGRA8原核表达载体,通过Western blot验证表明该重组蛋白具有很好的抗原性,可以做为鸡弓形虫病的诊断抗原。大量表达、纯化该重组蛋白后,进行ELISA板包被,经抗原包被量、一二抗、封闭液和底物等相关条件的摸索和优化后,确定了sGRA8的最佳工作浓度为1.7μg/ml,阴、阳性血清的最佳稀释倍数为1：10,二抗最佳稀释倍数为1:6000, sGRA8的最佳包被条件为37℃包被2h后4℃过夜,选用5%脱脂奶粉作为封闭液,最佳封闭时间为1h,抗体的反应时间为1h,酶标抗体最佳作用时间为1h,最佳显色时间10min。用构建的间接ELISA抗体检测法与RB公司的鸡弓形虫抗体检测试剂盒,对人工感染鸡弓形虫7-130d的阳性血清和阴性血清进行平行抗体检测的结果显示：7-45d内的符合率为98.26%,RB公司的试剂盒对60d后的血清无法检出阳性,而构建的间接ELISA对7-130d的阳性血清的检测敏感度达到80%-100%,且对7种鸡球虫、法氏囊、新城疫和大肠杆菌等鸡常见病原体阳性血清的检测未出现交叉反应。所以本方法是一个敏感性高、特异性强、检测时间长的鸡弓形虫检测法。