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背景淋巴瘤是目前世界上发病率较高的恶性肿瘤之一,原发于淋巴结或者淋巴结外淋巴组织,对人类健康产生很大的威胁。淋巴瘤是发生在淋巴和造血系统的恶性肿瘤,病理学将其划分为两大类,即霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma,HL)和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma,NHL)。NK/T细胞淋巴瘤(natural killer/T cell lymphoma,NKTCL)属于NHL的一种亚型,它的发病具有地域或种族易感性,多发于亚洲以及南美洲,我国此病的发病率呈逐渐上升趋势。NKTCL在2008年WHO分类中被正式命名为结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤(Extranodal NK/T cell lymphoma,ENKTCL)。ENKTCL最常见的原发部位是鼻咽部,但非鼻部区域包括皮肤和胃肠道在内的部位也可能会受到影响。在我国,ENKTCL是最常见的淋巴瘤类型之一,临床表现为高度侵袭性,病理学特征多为多形性肿瘤和血管浸润。ENKTCL通常发生在鼻/鼻旁区域,伴有显著的血管侵袭和血管破坏并伴有坏死。晚期常常出现各种并发症,预后较差。早期的ENKTCL患者对于放化疗效果尚可,但对于晚期ENKTCL患者,没有标准化的治疗方案。因此,开展关于ENKTCL的分子生物学研究,寻找对临床有效的治疗靶点,具有重要的意义。MicroRNA(miRNA)是一类小的,高度保守的单链非编码RNA,长度在18-24nt之间。MiRNA作为重要的反式作用因子,广泛存在于多细胞生物和单细胞生物体内,通过结合到靶基因的3’非翻译区域(3’-UTR)而在转录后水平调节靶mRNA的表达。许多miRNA已经被发现与特定类型或阶段的肿瘤有关,或与肿瘤患者的生存率有关,并可能发展作为诊断或预后评估标记物。因此,miRNA的功能研究将会从分子生物学角度对ENKTCL的诊断、分型、治疗靶点预测提供新的思路。MiR-148a基因是一种新型肌源性miRNA,它可以通过靶向调节性Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)促进成肌细胞和骨骼肌细胞的分化。MiR-148a表达的调节主要发生在染色体,转录和甲基化水平,它通过调节DNA甲基化转移酶(DNMT1)表达来抑制胃癌中的细胞侵袭和迁移。MiR-148a在胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌、食管癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和泌尿生殖系统肿瘤中均可检测到表达下调。然而,miR-148a在胶质瘤和骨肉瘤中的表达是上调的。MiR-148a在各种肿瘤中异常表达,被认为在肿瘤发生的分子机制中具有关键作用的致癌或肿瘤抑制剂。MiR-148a-3p是从miR-148a前体的3’端臂加工而来。目前关于miR-148a-3p在ENKTCL中的表达及生物学功能尚不清楚。MiR-449a基因属于miR-449基因家族,位于5号染色体的第二个内含子。这个区域(5q11.2)在早期全基因组关联研究中被确定为一个强烈的肿瘤易感性基因座。MiR-449a可以介导细胞周期停滞和细胞凋亡,并由此可能抑制肿瘤生长。目前关于miR-449a在ENKTCL中的表达及生物学功能未见相关文献报道。目的基于miRNA的重要分子调控作用,本实验采用石蜡包埋组织切片组织原位杂交的方法,利用地高辛标记的miR-148a-3p和miR-449a探针检测miR-148a-3p和miR-449a在ENKTCL患者石蜡组织标本中的表达情况,并通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技术确定这两种mi RNA在NK/T细胞淋巴瘤细胞株NK92和YT中的表达情况(实验采用正常人类NK细胞为阴性对照,以U6为阳性内参)。实验主要分析miR-148a-3p和miR-449a在ENKTCL与鼻腔黏膜慢性炎对照组织之间的表达是否存在差异,分析两种miRNA在NK/T细胞淋巴瘤细胞NK92和YT细胞及正常NK细胞之间的表达是否存在差异,以及以上两者的差异是否具有一致性。最后根据患者的临床预后参数及随访情况进一步分析miR-148a-3p和mi R-449a表达量与ENKTCL患者临床病理参数的关系及预后的相关性。简而言之,本实验的目的是为了研究miR-148a-3p和miR-449a在ENKTCL中的表达及其分子生物学意义,寻找与ENKTCL临床相关的诊断及治疗的分子靶点。方法1石蜡组织切片原位杂交(地高辛标记的miR-148a-3p、miR-449a探针)(1)收集并筛选2014年1月至2017年5月之间,在郑州大学第一附属医院明确诊断为ENKTCL并具有完整病例资料及随访资料的患者的石蜡组织标本共40例作为实验组,选取同时期20例鼻腔黏膜慢性炎患者的石蜡组织标本作为对照组。(2)使用地高辛标记的miRNA探针(miR-148a-3p和miR-449a),采用组织原位杂交的方法检测ENKTCL患者石蜡组织标本中miR-148a-3p和miR-449a的表达情况。2 qRT-PCR培养NK/T细胞淋巴瘤细胞株NK92和YT及正常NK细胞,收集细胞并分别提取细胞的总RNA,应用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA,采用qRT-PCR方法检测NK/T细胞淋巴瘤细胞与正常淋巴细胞之间miR-148a-3p和miR-449a的表达差异以及分析差异存在的意义。3统计分析用SPSS 21.0软件对miR-148a-3p和miR-449a表达与ENKTCL患者临床预后相关参数进行统计学分析,包括年龄、性别、B症状、血清LDH水平、Ann Arbor分期及IPI评分。Kaplan-Meier法单因素预后分析、Log-rank检验法及多因素COX回归模型分析miR-148a-3p和miR-449a在ENKTCL肿瘤组织与炎性对照组织中表达情况及以上临床病理参数与临床预后的相关性。结果1原位杂交结果:与对照组鼻腔粘膜慢性炎相比,ENKTCL组织中的miR-148a-3p和miR-449a的表达水平明显增高。2 qRT-PCR结果:miR-148a-3p和miR-449a在NK/T细胞淋巴瘤细胞株NK92及YT中的表达与正常NK细胞株比较,表达量都有明显上调。3 Kaplan-Meier法单因素预后分析结果:mi R-148a-3p的表达水平与ENKTCL患者的性别、年龄、血清LDH水平、IPI评分、B症状、Ann Arbor分期无关(P>0.05);mi R-449a的表达水平与ENKTCL患者的性别、年龄、血清LDH水平、IPI评分、B症状、Ann Arbor分期无关(P>0.05)。4 Log-rank检验法分析结果:将miR-148a-3p和miR-449a的表达与ENKTCL患者总生存率(OS)进行相关生存分析,结果显示miR-449a高表达组和miR-449a低表达组与总生存率的中位生存期无统计学差异(P>0.05),miR-148a-3p表达量与ENKTCL总生存率有相关性(P<0.05)。5多因素COX回归模型分析结果:miR-148a-3p表达水平及IPI评分与ENKTCL患者预后相关(P<0.05),而性别、发病年龄、B症状、Ann Arbor分期、血清LDH水平、mi R-449a表达水平与ENKTCL患者预后无关(P>0.05)。结论1 MiR-148a-3p和miR-449a在ENKTCL中异常表达,可能参与了肿瘤的发生发展。2 MiR-148a-3p高表达及IPI评分(>2分)可能是影响ENKTCL预后的危险因素。