肾脏移植是治疗终末期肾脏疾病的最有效手段之一,但到目前为止,仍有一些问题制约着肾移植的发展,现有免疫抑制药物会带来的各种不良反应和副作用,移植患者容易发生各种感染；免疫移植药物代谢的个体差异直接影响到临床药物剂量的调整,有部分患者的治疗窗非常狭窄,在发生严重感染的同时合并排斥反应。钙调神经蛋白抑制剂(calcineurin inhibitors, CNIs)类药物是器官移植术后免疫抑制方案的基石,但其有自身的缺点,CNIs类药物引起的慢性肾脏毒性是导致移植物远期存活率下降的主要原因之一。针对上述制约器官移植发展的问题,基础研究者和临床工作者在进行大量的探索,试图找到更为理想的解决方案。本研究将探索神经免疫调节手段在同种异体移植当中的作用。神经系统和免疫系统密不可分。在神经原性炎症中,P物质(substance P, SP)和降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)是神经纤维末梢最初释放的神经肽类物质,也是最重要的肽类物质,均可诱发神经性炎症反应,神经原性炎症以神经网络为基础,通过轴突反射和背根反射扩大作用范围,在神经原性炎症中,SP和CGRP表现为协同作用。免疫细胞表面表达特异性的神经肽类物质受体,神经肽能够与其结合,调节免疫细胞的功能,但SP和CGRP所表现出来的免疫学效应却截然相反：SP刺激T细胞增殖,CGRP抑制T细胞活化。由于神经网络具有广泛分布的特点,神经免疫调节具有迅速使大量免疫细胞的状态得到同化的潜能。而不同神经肽具有相反免疫学效应的特点提示基于神经免疫水平的调节可能是移植免疫中一个重要的调节点。基于神经水平的免疫调节由于间接作用于免疫器官和免疫细胞,可能具有传统免疫调节方法所不具备的特殊优点。但这种调节方法是否具有足够强的免疫调节能力,能否有效预防移植物的排斥反应还没有相关研究。本研究通过建立小鼠同种异基因皮肤移植模型,研究神经免疫调节对皮肤移植物的存活、Thl和Th2细胞亚群平衡、调节性T细胞(Tregs)和T淋巴细胞各活化通路关键信号分子的影响,初步探索神经免疫调节在同种异基因组织移植中所占的地位和作用。第一章小鼠同种异基因皮肤移植模型的建立目的：成功建立小鼠同种异基因皮肤移植模型。方法：分别对BALB/c小鼠进行自体皮肤移植和异基因皮肤移植,皮肤移植采用全厚皮片移植,观察并记录移植皮片的存活情况。结果：异基因皮肤移植小鼠术后4天,皮面光滑,开始转红,无浮动现象,7天时皮肤迅速出现排斥反应,皮肤皱缩、僵硬,呈干性坏死,出现黑痂状。自体皮肤移植小鼠术后6天,皮面光滑,开始转红,无浮动现象,打包固定期间,皮片未收缩,12天时全部皮片均已愈合牢固,柔韧性好,并开始长出皮毛。拆线后,皮片开始收缩,术后25天的收缩率达40-50%,以后未再继续收缩。结论：小鼠同种异基因全厚皮片移植模型建立成功；该模型是研究排斥反应和相应干预手段的理想动物模型；任何外科手术都会诱发不同程度的神经原性炎症,该动物模型是研究神经免疫调节的良好载体。第二章神经免疫调节对同种异基因皮肤移植小鼠皮肤移植物存活的影响目的：利用成功建立的小鼠皮肤移植模型,对接受皮肤移植的小鼠使用不同的神经肽受体拮抗剂进行干预,观察并比较各组皮肤移植物的存活时间。方法：对接受自体皮肤移植和异体皮肤移植的小鼠进行分组,分别施加生理盐水、SP受体拮抗剂Spantide、CGRP受体拮抗剂BIBN4096BS以及Spantide+BIBN4096BS干预,比较各组小鼠皮肤移植物的存活时间,皮肤移植物存活时间的组间比较采用Kaplan-Meier法。结果：观察时间为25天,自体皮肤移植小鼠的皮肤移植物平均存活25天；异基因皮肤移植注射生理盐水的对照组小鼠皮肤移植物平均存活时间为7天；异基因皮肤移植注射SP受体拮抗剂Spantide的小鼠皮肤移植物平均存活时间为13天；异基因皮肤移植注射CGRP受体拮抗剂BIBN4096BS的小鼠皮肤移植物平均存活时间为12天；异基因皮肤移植同时注射SP受体拮抗剂Spantide和CGRP受体拮抗剂BIBN4096BS的小鼠皮肤移植物平均存活时间为19天。结论：SP和CGRP调节均能够延长小鼠异基因皮肤移植物的存活时间；SP和CGRP调节在延长小鼠异基因皮肤移植物的存活时间方面无显著差异；SP/CGRP共同调节能进一步显著延长小鼠异基因皮肤移植物的存活时间,说明SP和CGRP调节在神经免疫学层面也具有协同作用；与传统免疫抑制药物相比,基于SP和CGRP的神经免疫调节对异基因皮肤移植物的存活时间延长作用有限,但不失为一种有潜力的研究方向。第三章小鼠皮肤移植物中SP和CGRP免疫组织化学分析和SP mRNA/CGRP mRNA荧光定量PCR分析目的：对小鼠皮肤移植物中的SP和CGRP从蛋白肽水平和基因水平进行定性和定量分析。方法：1、对小鼠皮肤移植物中的SP和CGRP进行免疫组化染色。2、对小鼠皮肤移植物中的SP mRNA/CGRP mRNA进行荧光定量PCR分析。3、荧光定量PCR结果的分析采用SPSS18.0统计分析软件,各指标组间比较采用方差分析,方差分析后,两两比较使用LSD法,两组间比较采用t检验。结果：1、免疫组化结果显示,自体皮肤移植小鼠皮肤移植物存活良好,表皮层厚度正常,可见皮肤附件；异体皮肤移植小鼠移植皮片表皮层变薄,皮肤附件消失。2、SP拮抗和CGRP拮抗均能同时抑制SP和CGRP的表达,SP+CGRP双重拮抗使得这种抑制效应更加明显。3、对施加同种干预的自体移植和异体移植小鼠进行比较,发现异基因皮肤移植组CGRP的表达程度明显低于自体皮肤移植组。4、对接受自体皮肤移植的小鼠进行组织内SP mRNA定量的组间比较,发现Ctrl②组SP mRNA的表达量显著高于SP②组和SP+CGRP②组,而与CGRP②组无显著差异；SP②组SP mRNA的表达量显著低于CGRP②组,与SP+CGRP②组SPmRNA的表达量无显著差异；CGRP②组SPmRNA的表达量显著高于SP+CGRP②组。5、对接受异体皮肤移植的小鼠进行组织内SP mRNA定量的组间比较,发现Ctrl①组SP mRNA的表达量显著高于SP①组、CGRP①组和SP+CGRP①组；SP①组SP mRNA的表达量显著低于CGRP①组和SP+CGRP①组;CGRP①组SP mRNA的表达量显著高于SP+CGRP①组。6、对接受自体皮肤移植的小鼠进行组织内CGRPmRNA定量的组间比较,发现Ctrl②组CGRP mRNA的表达量显著高于CGRP②组,而与SP②组和SP+CGRP②组无显著差异；SP②组CGRP mRNA的表达量显著高于CGRP②组和SP+CGRP②组;CGRP②组CGRP mRNA的表达量显著高于SP+CGRP②组。7、对接受异体皮肤移植的小鼠进行组织内CGRP mRNA定量的组间比较,发现Ctrl①组CGRP mRNA的表达量显著高于CGRP①组和SP+CGRP①组,而与SP①组无显著差异；SP①组CGRP mRNA的表达量显著高于CGRP①组和SP+CGRP①组;CGRP①组CGRP mRNA的表达量与SP+CGRP①组无显著差异.8、对接受同一干预的皮肤移植小鼠分别进行异体-自体之间SPmRNA表达量的比较：接受生理盐水注射的自体移植小鼠其皮肤移植物内SP mRNA表达量显著低于异体移植小鼠；接受SP受体拮抗剂的自体移植小鼠其皮肤移植物内SP mRNA表达量显著高于异体移植小鼠；接受CGRP受体拮抗剂的自体移植小鼠其皮肤移植物内SPmRNA表达量与异体移植小鼠无显著差异；接受SP+CGRP双重拮抗的自体移植小鼠其皮肤移植物内SP mRNA表达量显著低于异体移植小鼠。9、对接受同一干预的皮肤移植小鼠分别进行异体-自体之间CGRPmRNA表达量的比较：接受生理盐水注射的自体移植小鼠其皮肤移植物内CGRP mRNA表达量显著低于异体移植小鼠；接受SP受体拮抗剂的自体移植小鼠其皮肤移植物内CGRP mRNA表达量显著低于异体移植小鼠；接受CGRP受体拮抗剂的自体移植小鼠其皮肤移植物内CGRP mRNA表达量显著高于异体移植小鼠；接受SP+CGRP双重拮抗的自体移植小鼠其皮肤移植物内CGRP mRNA表达量显著高于异体移植小鼠。结论：在小鼠皮肤移植模型中,外科手术是神经原性炎症的始动因素,继发的神经原性炎症的自我增强和产生神经免疫学效应不依赖于外科手术的影响而独立存在；单一阻断SP与其受体结合不但影响SP的合成和表达,同时也影响CGRP的合成和表达；在单独使用CGRP拮抗剂的小鼠体内也观察到类似的现象,这说明SP和CGRP具有交叉反馈和协同作用；SP+CGRP双拮抗能进一步降低SP和CGRP的表达,但不能完全阻断SP和CGRP的表达,这可能是神经免疫调节一个重要的缺陷,也是本研究中异基因皮肤移植物存活时间不长的原因之一；机体在面对异基因移植物时,可能会在神经免疫学层面产生一种免疫增强机制,加速免疫反应对皮肤移植物的破坏,而SP+CGRP双拮抗能有效减弱这种效应；在神经免疫调节过程中,神经肽mRNA的表达和神经肽的产生并不呈绝对的线性关系；与神经原性炎症相比,同种异体免疫反应能够显著促进皮肤移植物中SPmRNA的表达。第四章皮肤移植小鼠外周血Thl因子和Th2因子的检测目的：通过检测接受皮肤移植小鼠外周血中的Thl因子IFN-γ、IL-2和Th2因子IL-10,间接评估神经免疫调节对小鼠免疫系统的影响。方法：1、利用ELISA技术对小鼠外周血中的Thl因子IFN-γ和IL-2进行定量检测。2、利用ELISA技术对小鼠外周血中的Th2因子IL-10进行定量检测。3、采用SPSS18.0统计分析软件对检测结果进行分析,各指标组间比较采用方差分析,方差分析后,两两比较使用LSD法,两组间比较采用t检验。结果：1、神经免疫调节使接受自体/异体皮肤移植的小鼠外周血IFN-γ表达量下降,且影响作用的大小依次为SP+CGRP双重拮抗>CGRP拮抗>SP拮抗>NS。2、神经免疫调节使接受自体/异体皮肤移植的小鼠外周血IL-2表达量下降,且影响作用的大小依次为SP+CGRP双重拮抗>CGRP拮抗>SP拮抗>NS。3、神经免疫调节使接受自体/异体皮肤移植的小鼠外周血IL-10表达量增加,且影响作用的大小依次为SP+CGRP双重拮抗>CGRP拮抗>SP拮抗>NS。4、对接受不同干预措施的小鼠进行组间自体-异体比较,发现异体移植小鼠外周血IL-2、IFN-γ、IL-10的表达量均低于自体移植组,且绝大部分干预组均有显著差异。结论：1、从Th1和Th2亚群细胞因子的角度进行分析,基于SP和CGRP的神经免疫调节确实能够对异基因皮肤移植物产生保护作用,这种保护作用的强度表现为:SP+CGRP双重拮抗>CGRP拮抗>SP拮抗。2、在自体皮肤移植组,神经肽拮抗剂也能引起Th1因子和Th2因子产生类似于异基因皮肤移植小鼠外周血表达含量的变化,这说明这种神经免疫调节手段对免疫系统的影响不依赖于异基因免疫反应的存在。3、GCRP拮抗对异基因皮肤移植组小鼠Th1因子的影响要大于对自体皮肤移植组小鼠Th1因子的影响,这种调节方式对Th2因子的影响在两组之间则没有体现出差异,这可能与CGRP在异基因皮肤移植小鼠模型中表达下降有关,这也是本研究所揭示的CGRP拮抗所产生的免疫保护作用强于SP拮抗的原因。第五章小鼠淋巴细胞活化通路关键信号分子定量分析目的：对皮肤移植小鼠淋巴细胞活化三条通路上的关键信号分子进行定量分析,检测神经免疫调节手段会如何对上述通路产生影响,方法：1、利用荧光定量PCR技术对小鼠MAPK通路信号分子的表达进行定量分析。2、利用荧光定量PCR技术对小鼠Calcineurin/NFAT通路信号分子的表达进行定量分析。3、利用荧光定量PCR技术对小鼠JAK-STAT通路信号分子的表达进行定量分析。4、采用SPSS18.0统计分析软件对检测结果进行分析,各指标组间比较采用方差分析,方差分析后,两两比较使用LSD法,两组间比较采用t检验。结果：1、对MAPK通路的4个关键信号分子进行定量分析,发现基于SP/CGRP的神经免疫调节手段对ERK基因表达无影响；对JNK2基因表达的影响可能主要和炎症反应有关；该调节对JNK1基因和P38MAPK基因表达产生的影响正好相反：SP调节促进自体皮肤移植小鼠P38MAPK基因的表达,抑制异体皮肤移植小鼠JNK1基因的表达,CGRP调节抑制异体皮肤移植小鼠P38MAPK基因的表达,促进自体皮肤移植小鼠JNK1基因的表达。2、对Calcineurin/NFAT通路的2个基因进行了定量分析,发现神经免疫调节能够同时促进Calcineurin/NFAT通路中的NFAT基因和Calcineurin基因表达增加,其中SP调节诱导NFAT基因表达的作用较强,而CGRP调节诱导Calcineurin基因表达的作用较强。3、对JAK/STAT通路的2个基因进行了定量分析,发现神经免疫调节对JAK1基因和Tyk2的表达几乎无明显影响。结论：1、基于SP/CGRP的神经免疫调节手段对MAPK通路的ERK基因和JNK2基因表达无影响或与移植物的存活无关；对JNK1基因和P38MAPK基因表达产生的影响正好相反：SP调节促进自体皮肤移植小鼠P38MAPK基因的表达,抑制异体皮肤移植小鼠JNK1基因的表达,CGRP调节抑制异体皮肤移植小鼠P38MAPK基因的表达,促进自体皮肤移植小鼠JNK1基因的表达。2、基于SP/CGRP的神经免疫调节手段能够同时促进Calcineurin/NFAT通路中的NFAT基因和Calcineurin基因表达增加,其中SP调节诱导NFAT基因表达的作用较强,而CGRP调节诱导Calcineurin基因表达的作用较强。3、基于SP/CGRP的神经免疫调节对JAK1基因表达无影响；对异体移植小鼠Tyk2的表达几乎无明显影响。第六章小鼠外周血CD4+CD25+Treg和Foxp3的表达检测目的：探索神经免疫调节是否具有足够的诱导CD4+CD25+Treg形成的能力。方法：1.利用荧光定量PCR技术对小鼠皮肤移植物中的Foxp3进行定量分析；2.利用流式细胞技术对小鼠外周血中的CD4+CD25+Treg细胞进行分选和检测；3.荧光定量PCR的结果使用SPSS18.0进行分析,流式细胞技术的结果使用BD FACS CantoTMll统计软件进行分析。各指标组间比较采用方差分析,方差分析后,两两比较使用LSD法,两组间比较采用t检验。结果：1.接受神经免疫调节的小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的百分比升高,这种调节方式对Treg的影响程度依次为SP调节>SP+CGRP调节>CGRP调节>NS对照(P<0.05)；2.将施加同一种干预的自体移植小鼠和异体移植小鼠进行比较,发现各组自体移植小鼠外周血中CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的百分比均显著低于异体移植小鼠(P<0.05)；3. Foxp3mRNA定量的结果和CD4+CD25+Foxp3+Tregs流式细胞检测的结果并不完全一致,这可能是由于标本来源不同所致。结论：1.神经免疫调节能够促使小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的百分比升高；2.神经免疫调节方式对Treg的影响程度依次为：SP调节>SP+CGRP调节>CGRP调节>NS对照