目的:从硫氧还蛋白相互作用蛋白(thiomdoxin interaction protein,TXNIP)介导NLRP3炎症小体激活途径研究三七总皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)减轻衰老大鼠神经炎症反应的作用机制,为防治衰老相关神经退行性疾病提供理论基础和实验室依据。方法:体内实验:以SPF级雄性SD大鼠为研究对象,将45只18月龄的大鼠随机分为24月龄组(24M)、PNS低剂量组(10 mg/kg)、PNS高剂量组(30 mg/kg),每组15只。PNS低、高剂量组每天投食给药,给药6个月。从给药的第二个月开始另外购买15只2月龄大鼠作为青年对照,记为6月龄组(6M),6M与24M组大鼠正常投食。(1)采用HE染色法观察PNS对衰老大鼠脑组织皮层及海马CA1、CA3区细胞形态结构的影响。采用免疫荧光法检测PNS对衰老大鼠脑组织皮层及海马CA1、CA3区中小胶质细胞数量的影响。采用免疫荧光法检测衰老大鼠脑组织皮层及海马CA1、CA3区中NOD样受体3(NOD-like receptor 3,NLRP3)和TXNIP与小胶质细胞标记物Iba-1的共定位情况。采用Western Blot法检测PNS对衰老大鼠皮层及海马组织中神经炎性因子白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)及NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)及TXNIP蛋白表达的影响。体外实验:(1)用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)共刺激,建立NLRP3炎症小体激活模型,观察PNS的保护作用。将细胞分为正常对照组(Control)、模型组(LPS+ATP)、PNS低剂量组(25μg/mL)、PNS高剂量组(50μg/mL)。LPS浓度为1μg/mL,刺激6 h,ATP浓度为2 mmol/L,刺激30 min。采用MTT法检测PNS对BV2小胶质细胞的细胞活力的影响。采用Western Blot法及免疫荧光法检测PNS对IL-1β、NLRP3、ASC、Caspase-1及TXNIP蛋白表达的影响。(2)加入TXNIP的抑制剂维拉帕米(Verapamil)后再用LPS和ATP联合刺激BV2小胶质细胞。采用Western Blot法及免疫荧光法检测IL-1β、NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的表达变化。采用ROS荧光探针-DHE法检测TXNIP在PNS对LPS和ATP共刺激所致BV2小胶质细胞活性氧含量的影响。结果:体内实验:(1)HE染色结果显示,与6M组大鼠相比,24M组大鼠脑组织皮层及海马CA1、CA3区神经细胞排列紊乱,细胞体积变小且细胞着色较深,胞体呈不规则形;与24M组大鼠相比,PNS给药组(10 mg/kg和30 mg/kg)的神经细胞排列较整齐,且细胞着色较浅,胞体呈圆形。免疫荧光结果显示,与6M组大鼠相比,24M组大鼠脑组织皮层及海马CA1、CA3区中小胶质细胞的数量明显增多,在PNS(10mg/kg和30 mg/kg)的干预下,小胶质细胞数量减少。同时,在大鼠皮层、海马CA1、CA3区中NLRP3和TXNIP与小胶质细胞都有共定位表达。Western Blot结果显示,与6M组大鼠相比,24M组大鼠皮层及海马组织中IL-1β、NLRP3、ASC、Caspase-1及TXNIP蛋白的表达显著上升(P<0.05或P<0.01),给予PNS(10 mg/kg和30 mg/kg)干预后,各剂量组均能下调上述蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。体外实验:(1)MTT结果显示,与正常对照组相比,PNS(6.25μg/mL,12.5μg/mL,25μg/mL和50μg/mL)对BV2小胶质细胞的活力无影响,但在100μg/mL和200μg/mL时可降低细胞活力,且200μg/mL时活力明显降低(P<0.01)。因此,我们选择PNS6.25μg/mL,12.5μg/mL,25μg/mL和50μg/mL的剂量用于检测PNS对LPS和ATP共刺激所致BV2小胶质细胞活力的影响。与正常对照组相比,LPS+ATP刺激组BV2小胶质细胞的细胞活力明显下降(P<0.01);给予不同浓度的PNS(6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/ml和50μg/mL)干预后,各浓度PNS均能提高BV2小胶质细胞的细胞活力(P<0.05或P<0.01),且PNS浓度为25μg/ml和50μg/mL时效果最佳。Western Blot及免疫荧光结果显示,PNS(25μg/ml和50μg/mL)能降低LPS+ATP刺激组IL-1β、NLRP3、ASC、Caspase-1及TXNIP蛋白的表达水平(P<0.05或P<0.01)。(2)给予TXNIP的抑制剂Verapamil后再用LPS和ATP联合刺激BV2小胶质细胞。Western Blot及免疫荧光结果显示,TXNIP被抑制后,模型组IL-1β、NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的表达降低(P<0.05、P<0.05或P<0.01)。ROS荧光探针-DHE结果显示,与正常组相比,LPS和ATP共刺激后BV2小胶质细胞中活性氧含量明显增多;TXNIP被抑制后,BV2小胶质细胞中活性氧含量明显降低。结论:三七总皂苷能减轻衰老大鼠脑组织皮层及海马部位的神经炎症反应。三七总皂苷能降低NLRP3炎症小体及炎性因子的表达,减少活性氧的产生,有较好的抗炎效果,其机制可能与TXNIP介导的NLRP3炎症小体激活途径有关。