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目的分析补充肉碱对严重烫伤大鼠血清肉碱水平、脂肪酸代谢水平、肝细胞及线粒体损伤水平的影响,并通过细胞实验分析肉碱通过调节脂代谢关键酶活性对肝细胞线粒体损伤的保护机制,从而为通过补充外源性肉碱减轻严重烧伤患者肝细胞线粒体损伤的保护机制提供理论依据。方法1.动物实验:通过建立重度烫伤并给予尾静脉补液复苏的SD大鼠模型,观察伤后第12h、24h、48h、72h四个时相点中control、burn、carnitine三组大鼠血清肉碱、LDH、ALT、AST、OCT、β-HB水平变化趋势,作为初期阶段实验。选择其中一个典型时相点(伤后24h)做进一步研究,检测血清及肝组织中TG水平,观察肝细胞中TG分布的变化以及肝组织形态学病理改变。检测肝细胞线粒体CPT1酶活性水平、CPT1αRNA表达水平、线粒体膜电位水平的变化,检测肝细胞凋亡水平的变化。电镜观察肝组织亚细胞结构的病理改变。取三组大鼠肝组织进行全RNA组学的高通量测序,从中选择出表达量差异有统计学意义的对脂肪代谢有影响的基因RNA序列(Acacb,Acsm5,Fabp4,Pnpla3),在细胞实验中进行验证。2.细胞实验:选择Hep G2细胞作为体外试验细胞株。用200μM etomoxir模拟线粒体CPT1酶活性受抑制情况,分别检测control、etomoxir、carnitine三组细胞培养上清中肉碱、LDH、ALT、AST、OCT、β-HB水平变化及细胞内TG水平的变化,观察细胞中TG分布的变化,检测细胞线粒体CPT1酶活性水平、CPT1αRNA表达水平、线粒体膜电位水平的变化,检测细胞ATP生成量及凋亡水平的变化。观察脂代谢有关基因的RNA(Acacb,Acsm5,Fabp4,Pnpla3)表达水平的变化。3.临床观察:观察临床治疗中危重烧伤患者血清肉碱、LDH、ALT、AST、OCT、β-HB、TG水平变化。结果1.动物实验(1)Burn组大鼠血清肉碱水平伤后12h即明显下降,然后呈缓慢恢复趋势,至伤后72h仍低于control组。经补充肉碱后,carnitine组大鼠血清肉碱水平恢复周期短于burn组,在伤后72h,carnitine组大鼠血清肉碱水平接近control组;在伤后12h,burn组大鼠血清LDH、ALT、AST水平即达到异常高峰,然后呈逐渐降低趋势,至伤后72h仍高于control组。carnitine组大鼠血清LDH、ALT、AST水平也在伤后12h达到异常高峰,但其恢复周期短于burn组,在伤后48h,carnitine组大鼠血清LDH、ALT、AST水平接近control组;在伤后12h,burn组大鼠血清OCT水平即达到异常高峰,然后呈逐渐降低趋势,至伤后72h仍高于control组。Carnitine组大鼠血清OCT水平也在伤后12h达到异常高峰,至伤后72h仍高于control组,但在伤后各时相点OCT水平均低于burn组;在伤后12h,burn组大鼠血清β-HB水平即达到异常低点,然后呈逐渐恢复趋势,至伤后72h仍低于control组。Carnitine组大鼠血清β-HB水平也在伤后12h达到异常低点,至伤后72h仍低于control组,但在伤后各时相点β-HB水平均高于burn组。(2)烫伤后24h,三组大鼠血清中TG水平无明显差异;而三组大鼠肝组织匀浆液中TG水平总体有差异,burn、carnitine组大鼠肝组织TG水平均高于control组,carnitine组低于burn组;Burn组大鼠肝组织切片中肝细胞排列紊乱,中心静脉萎缩,汇管区扩张。急慢性炎细胞浸润增加。小血管充血。Burn组大鼠肝组织可见大量脂滴。Carnitine组病理变化相比burn组有所减轻。Burn、carnitine组油红染色面积均多于control组,carnitine组油红染色面积低于burn组;Burn、carnitine组大鼠肝细胞线粒体CPT1酶活性水平均低于control组。Carnitine组高于burn组;Burn、carnitine组大鼠肝细胞线粒体CPT1αRNA表达量水平均高于control组。Carnitine组高于burn组;Burn、carnitine组肝细胞线粒体膜电位均水平低于control组。Carnitine组高于burn组;在电镜下,burn组大鼠肝组织可见线粒体萎缩,线粒体嵴不清晰,内质网肿胀。Carnitine组大鼠肝组织线粒体及内质网病理变化较burn组减轻;Burn组肝细胞凋亡数高于control组。Carnitine组与control组相近。Carnitine组低于burn组。(3)3组大鼠肝细胞中m RNA表达量在Acacb,Fabp4,Pnpla3三种基因中有统计学差异。其中burn组Fabp4基因的表达量高于control组。Carnitine组Acacb,Pnpla3基因的表达量高于burn组,Fabp4基因的表达量低于burn组。2.细胞实验(1)3组细胞上清肉碱水平总体比较,差异有统计学意义。Carnitine组上清肉碱水平高于control组和etomoxir组;Etomoxir组细胞线粒体CPT1酶活性水平降低,carnitine组CPT1酶活性水平与control组接近;Etomoxir组和carnitine组的CPT1αRNA表达量水平均增高。(2)Etomoxir组β-HB水平较control组降低,而carnitine组β-HB水平有所恢复,与control组接近;3组细胞ATP水平总体比较,差异没有统计学意义,carnitine组ATP水平更接近于control组。(3)Etomoxir组细胞内TG水平高于control组,carnitine组TG水平低于etomoxir组;通过油红染色可观察到,etomoxir组细胞内大量脂滴形成,carnitine组细胞内可见少量脂滴。Etomoxir、carnitine组油红染色面积均多于control,carnitine组油红染色面积低于etomoxir组。(4)Carnitine组细胞线粒体膜电位水平高于etomoxir组;Carnitine组上清OCT水平低于etomoxir组;Carnitine组细胞凋亡水平低于etomoxir组;Carnitine组细胞上清LDH、ALT、AST水平低于etomoxir组。(5)3组细胞在Acacb,Fabp4两种基因中RNA表达量有统计学差异。其中carnitine组Acacb基因的表达量高于control、etomoxir组。Etomoxir、carnitine组Fabp4基因的表达量高于control组,carnitine组Fabp4基因的表达量低于etomoxir组。3.临床观察在伤后24h,重症烧伤患者血清中LDH、ALT、AST、OCT水平异常升高,肉碱、β-HB水平降低,TG水平无明显差异。结论1.通过动物模型实验和临床观察,我们发现补充肉碱可以快速、有效恢复机体血清肉碱水平,恢复线粒体生酮能力。补充肉碱可恢复肝细胞CPT1酶活性,促进CPT1αRNA表达量增高,改善脂肪酸代谢,减轻脂质积聚,恢复线粒体膜电位水平,减轻线粒体损伤,减少细胞凋亡。2.通过Hep G2细胞模型,我们发现肉碱可能通过提高CPT1酶活性、促进CPT1αRNA表达量增高,来改善肝细胞内长链脂肪酸的转运以及线粒体的脂肪酸氧化。从而可以一方面减轻细胞质中的脂质积聚,减少脂毒性物质的形成和积聚。另一方面可以提高线粒体生酮能力,维持细胞ATP生成量,起到维持线粒体膜电位的稳定性的作用。进而减轻线粒体的损伤,最终达到减少细胞凋亡的效果。3.严重烫伤后机体存在肝组织中与脂肪酸代谢有关基因表达量有变化,补充肉碱后对脂代谢相关基因表达量变化有影响。在动物模型中表现为肉碱对肝组织中三种基因(Acacb,Fabp4,Pnpla3)m RNA表达量变化有影响。在细胞模型中表现为肉碱对Acacb,Fabp4两种基因表达量变化有影响。