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糖皮质激素受体(glucocorticoidreceptor，GR)突变和库兴综合症(CushingSyndrome)及各种自身免疫疾病有关。GR的配基(glucocorticoid，GC)，包括地塞米松、强地松等糖皮质量激素被广泛用于哮喘、过敏性鼻炎、类风湿性关节炎和白血病的治疗。然而临床使用皮质类固醇激素由于糖皮质激素抵抗的问题受到了很大的限制。GR是核受体家族中的重要成员，其也是一种重要的核转录调控因子，GR与糖皮质激素的生物学效应需要由GR介导，GR与GC相作用才能发挥作用。GR基因结构的发生点突变或者碱基插入或者缺失都会使GR的结构及功能发生改变而导致糖皮质激素抵抗。关于糖皮质激素抵抗的机制已研究多年，但未最终解决。大量的研究结果表明GR的基因结构异常而导致的GR氨基酸改变是导致糖皮质激素抵抗的常见原因之一。对两个家族性糖皮质激素抵抗的研究发现，在与GC结合的激素结合区的点突变使GR与GC之间的亲和力降低而造成糖皮质激素抵抗。
我们以前的研究结果表明GR的2349的基因位点有一腺嘌呤核苷酸插入而导致GR多合成20个氨基酸可能和狼疮性肾炎的发病有关[3]。由于大量研究表明糖皮质激素受体的基因改变是导致糖皮质激素抵抗的重要原因，我们拟从GR基因突变的与糖皮质激素抵抗之间的关系进行研究。我们在PRSHGRα质粒的基础上用定点诱变的方法构建了糖皮质激素受体α亚型的M565R、C638S、L753F、A573Q、GR2439insA五个诱变体，用野生型GR及M565R、C638S、L753F、A573Q、GR2439insA五个诱变体瞬时转染COS-7细胞，用RT-PCR及Westernblot的方法检测COS-7细胞转染后的受体表达情况，用野生型GR及各诱变体基因与报告基因PMMTV-CAT及PCH110质粒共转染COS-7细胞后测定氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达情况以评估各诱变体的转录功能改变。用野生型GR及各诱变体基因转染COS-7细胞后，加入LPS刺激COS-7细胞，造成COS-7细胞的炎症状态，然后加入地塞米松作用于COS-7细胞，测定转染后COS-7细胞在地塞米松作用下的TGF-β1的表达抑制率以比较野生型GR及各GR诱变体的抗炎功能。
研究目的：用瞬时转染的方法将编码糖皮质激素受体α亚型的WtGR、M565R、C638S、A573Q、L753F、GR2349insA质粒转入COS-7细胞，用RT-PCR及Westernblot检测转染后的GR表达情况，然后检测各诱变体在COS-7细胞中表达后与野生型GR相比较所发生的功能改变。
研究方法：1.我们用Quickchange定点诱变试剂盒用双引物诱变法成功构建了M565R、C638S、A573Q、L753F、GR2349insA五个诱变体。用高糖无酚红DMEM培养基培养COS-7细胞，用pEGFP质粒转染COS-7细胞以优化转染条件。用RT-PCR的方法检测转染COS-7后48小时GR的mRNA的表达，用Westernblot的方法检测转染COS-7细胞65小时后GR的蛋白表达情况，RT-PCR及Westernblot的检测结果表明野生型GR及各诱变体在瞬时转染COS-7细胞后均有稳定表达。
2.我们在瞬时转染COS-7细胞48小时后用放射免疫的方法检测野生型GR及各诱变体的配体-配基亲和力(Kd)及最大结合容量(RT)。用PRSHGRα质粒或各诱变体与PMMTV-CAT质粒及PCH110质粒共转染COS-7细胞，在0、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L地塞米松的作用下观察野生型GR及各诱变体的转录功能改变，每种GR质粒进行三次共转染实验。检测各GR质粒转染COS-7细胞后在地塞米松的作用下的TGF-β1制率以评价检测各诱变体的抗炎功能：每个GR质粒的转染进行三个细胞培养孔的对照实验，第一孔只进行转染实验，第二孔和第三孔转染后48小时加入200ng/ml(培养液终浓度)的LPS(转染+LPS组)，第三孔转染后60小时加入10-5mol/L的地塞米松(转染+LPS+地塞米松组)，转染72小时检测三个组的TGF-β1的表达情况，每个质粒进行三个平行转染实验。
研究结果：1.用pEGFP转染COS-7细胞48小时后获得比较高的转染效率，可达70％以上。
2.用RT-PCR的方法均可在GR及各诱变体转染COS-7细胞48小时后检测到GRmRNA的表达。
3.用Westernblot的方法检测GR及各诱变体转染COS-7细胞65小时后均可检测到分子量为94KD的蛋白质表达。
4.放射性配体-配基竞争抑制实验测定GR及各诱变体的KD值和RT值显示：wtGR的KD值为4.25nM，RT值为84.82fmol/mgpro；M565R的KD值为0.126nM，RT值为99.45fmol/mgpro；A573Q的KD值为0.336nM，RT值为88.71fmol/mgpro；C638S的KD值为0.386nM，RT值为98.8fmol/mgpro4；L753F的KD值为42.4nM，RT值为53.31fmol/mgpro：GR2349insA的KD值为46.9nM，RT值为59.62fmol/mgpro。
5.M565R、C638S、A573Q、L753F、GR2349insA和在不同浓度地塞米松诱导下和野生型GR的CAT表达量比较均有显著性差异(P＜0.05)。其中A573Q的CAT最大激活浓度2倍于野生型GR。M565R、C638S、A573Q在相同的地塞米松作用下CAT的诱导表达量均高于野生型GR(P＜0.05)：L753F、GR2349insA在相同地塞米松作用下CAT的诱导表达量均低于野生型GR(P＜0.05)。
6.通过测定wtGR、M565R、C638S、A573Q、L753F、GR2349insA在地塞米松作用下对LPS诱导的COS-7细胞的TGF-β1表达升高的抑制作用，结果显示各单纯转染细胞体系的TGF-β1的表达无显著性差异(P＞0.05)。经过LPS作用下再加入10-5mol/L的地塞米松后wtGR、M565R、C638S、A573Q转染组的TGF-β1表达量与未加地塞米松组相比较显著降低(P＜0.05)，而L753F、GR2349insA的TGF-β1的表达量无显著变化(P＞0.05)。M565R、C638S、A573Q组在地塞米松作用下的TGF-β1表达抑制率均高于野生型GR(P＜0.05)，而L753F、GR2349insA的TGF-β1的表达抑制率低于野生型(P＜0.05)。
结论：1.在PRSHGRα质粒的基础上成功构建了M565R、C638S、A573Q、L753F、GR2349insA的糖皮质激素受体α亚型诱变体。
2.wtGR及M565R、C638S、A573Q、L753F、GR2349insA转染COS-7细胞后均可在48～72小时之内稳定表达GR蛋白。
3.M565R、C638S、A573Q为高亲和力受体，L753F、GR2349insA为低亲和力受体。
4.M565R、C638S、A573Q的转录功能显著高于野生型GR(P＜0.05)，而L753F、GR2349insA的转录功能显著低于野生型GR(P＜0.05)。
5.M565R、C638S、A573Q受体在10-5mol/L的地塞米松的作用下对200ng/ml终浓度LPS诱导下的TGF-β1表达抑制率显著高于野生型GR(P＜0.05)，而L753F、GR2349insA转染体系在相同地塞米松浓度的作用下TGF-β1的表达水平与不加地塞米松的转染体系无显著性差异(P＜0.05)。M565R、C638S、A573Q受体在地塞米松作用下的抗炎能力高于GR，而L753F、GR2349insA的抗炎功能低下。