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研究目的肿瘤的治疗是一个世界性的难题,攻克癌症术后的复发和转移是当今医学科技攻关的重点与难点。四跨膜蛋白超家族中,CD151是其中重要的分子,其高表达于上皮细胞、内皮细胞、平滑肌和横纹肌细胞、血小板。其参与了多种生物过程,包括细胞粘附、增殖、分化,信号传导,病理性血管的生成和转移等。研究显示,CD151与多种肿瘤相关,其高表达多显示肿瘤病人预后不良。而CD151可以通过胞外大环特异性位点QRD194-196与整合素α3β1或α6β1相连,形成CD151-α3β1/α6β1功能性复合体,从而发挥多种生物学作用。在我们前期的实验研究生发现,CD151对于动物缺血模型有显著的促进血管新生的作用,且这些作用依赖于整合素α3β1/α6β1与CD151形成功能性的复合体。本实验中我们引入前期构建好CD151突变体pAAV-CD151-AAA194-196、体外转染HepG2细胞,观察其对细胞增殖、迁移、侵袭力影响,及其与整合素a3、a6、β1的关系,同时观察观察该突变体Cdc42和Rac1/2/3通路的影响,探讨CD151体外对肿瘤细胞生长的作用及其与整合素的相关性和机制的研究。研究方法1.用去内毒素试剂盒提取pAAV-CD151以及pAAV-CD151-AAA194-196、 pAAV-GFP三种质粒,并基因测序鉴定。2.Attractene Transfection Reagent脂质体转染HepG2细胞,分为四组,pAAV-CD151组、pAAV-CD151-AAA194-196组、pAAV-GFP组和空白对照组。成功转染后提取细胞蛋白,Western blot法检测各组CD151的表达,干预后CCK-8法观察细胞的增殖,细胞划痕实验观察各转染组细胞的迁移力,用Transwell板(孔径8μm),观察各组细胞侵袭力的情况,免疫共沉淀法检测各组整合素a3、a6、β1的表达情况,Western blot去观察各组Cdc42、Rac1/2/3和P-Rac/Cdc42的表达情况。实验结果1.经过基因测序鉴定,成功提取了pAAV-CD151和pAAV-CD151-AAA194-196两种质粒。2.pAAV-CD151-AAA194-196转染组与pAAV-CD151转染组CD151的表达无明显差异。3pAAV-CD151-AAA194-196转染组体外促进HepG2细胞增殖能力较pAAV-CD151转染组减弱。4.pAAV-CD151-AAA194-196转染组体外促进HepG2细胞迁移能力较pAAV-CD151转染组减弱。5.pAAV-CD151-AAA194-196转染组对HepG2细胞侵袭力的作用不及pAAV-CD151转染组,pAAV-CD151转染组能显著增强HepG2细胞侵袭力。6pAAV-CD151转染组P-Rac/Cdc42的表达增强,而突变体转染组未见到此效应。7.免疫共沉淀法检测到pAAV-CD151转染组整合素a3、a6、β1的表达,突变体组未检测到整合素a3、 a6、β1的表达。实验结论1.课题组成功构建了pAAV-CD151-AAA194-196突变体。2.研究表明pAAV-CD151能显著促进HepG2细胞的增值、迁移和侵袭,而突变体组促进HepG2细胞的增值、迁移和侵袭较pAAV-CD151组减弱,pAAV-CD151的此些作用可能通过上调P-Rac/Cdc42的表达来实现。3pAAV-CD151体外促进HepG2细胞的增值、迁移和侵袭依赖于CD151-整合素α3β1/α6β1复合体的形成。