论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸障碍综合征(Porcine Reproductive and Respiration Syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种高度接触性传染病,以母猪的生殖障碍和生长猪及仔猪的严重呼吸道疾病为主要特征。是目前危害养猪业的传染病之一。该病毒有4种糖基化蛋白GP2、GP3、GP4、GP5和2种非糖基化蛋白M和N蛋白,其中,M蛋白能诱导细胞免疫反应。目前用于预防PRRS的疫苗有弱毒苗和灭活苗。弱毒苗诱导的抗体只能抵抗同源毒株的入侵,同时有散毒的危险。灭活苗诱导产生的抗体水平很低,不能产生足够的免疫保护,常导致免疫失败；同时,高滴度的抗体不能清除病毒,而且能产生抗体依赖性增强作用。而细胞免疫在疾病的预防中起到了至关重要的作用。本研究利用原核表达系统对江苏分离的高致病性毒株的M基因进行分段表达,初步鉴定其CD4+T细胞表位优势区域。利用RT-PCR方法从PRRSV江苏毒株中克隆得到了大小约649bp片段的M蛋白基因,将其克隆到pMD-18T载体后进行测序。利用DNAstar软件进行分析,结果表明该江苏株属于美洲型,同时将其与VR2332、BJ-4、CC-1、CH-1a、HB-1、Hn-1、JXwn06、resp、S1、HUB2、HEB1、JXA1、LV等分离株进行了同源性分析,与最近几年分离的HUB2、HEB1、JXA1、JXwn06同源性极高,核苷酸同源性达到99%以上,氨基酸同源性达99.4%,而与其他毒株同源性相对较远,变异株M蛋白基因序列与美洲经典毒株VR2332M蛋白基因序列核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为94.9%和97.1%,可见M蛋白基因是非常保守的,其毒株的变异并不影响M蛋白的免疫活性.所以,M蛋白T细胞免疫优势区的筛选和鉴定对下一步开发有效的新型疫苗来说是非常重要的。研究表明CD4+辅助性T细胞表位均为双亲性的α螺旋,采用DNAstar对M蛋白结构和其双亲性进行分析进行分析的基础上,将其进行分段表达,根据PRRSV江苏株M基因序列设计表达引物,扩增出两端带有Bam HⅠ和Hin dⅢ的M1 (294bp、AA78-174)、K1 (AA78-112)、K2 (AA98-131)、K3 (AA118-153)、K4 (AA139-174)蛋白基因,亚克隆到原核表达载体pET32a+中构建了重组表达质粒pET-M1、K1、K2、K3、K4,转化BL21表达菌,在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为30.8 KD和24.4 KD的融合蛋白M1、K1、K2、K3、K4-His,通过对表达条件进一步优化,均获得高效表达。经SDS-PAGE和Western blot鉴定,这些蛋白均具有良好的抗原性,表达量约占细菌总蛋白量的39%左右。应用镍树脂层析纯化柱对重组融合蛋白进行纯化,纯化的融合蛋白经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白纯度高达95%以上。用M1蛋白免疫BALB/C小鼠,并设PRRSV全病毒对照组。于三免后两周采血。小鼠血清中未检测到有中和抗体的存在。并从小鼠脾脏分离淋巴细胞,分别用K1、K2、K3、K4蛋白进行体外刺激。流式细胞仪检测分泌IFN-γ细胞因子的T细胞的频率,结果用SPSS软件分析,两个免疫组K1蛋白与对照相比较,差异均显著(P≤0.01),用蛋白进行体外刺激后,其中M1蛋白免疫组,K1蛋白刺激后分泌IFN-γ的细胞比率达到1.01%,而相应的全病毒组为0.24%,其它蛋白分别与对照组比较,差异均不显著。试验结果表明M蛋白K1 (AA78-112)可能是T淋巴细胞表位优势区。