亚低温对LPS介导的小胶质细胞TLR4/NF-kappaB信号通路的影响

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脓毒症(Sepsis)是由感染引起的全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS)。小胶质细胞(microglia,MG)是神经系统内的免疫细胞,主要表达TLR4受体,其TLR4都存在于细胞膜上,可特异地识别脂多糖,触发SIRS。亚低温在神经系统的各种疾病的治疗中已取得了明显的优势,并被列入2010年的美国心肺复苏指南。但亚低温对脓毒症病程中脑保护的机制尚不清楚。我们进行此项研究,以了解亚低温是否通过影响小胶质细胞的TLR4/NF-kappa B信号通路从而抑制炎症因子的释放,达到神经系统的保护作用。目的:了解亚低温治疗对内毒素(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小胶质细胞的TLR4/NF-kappa B信号通路的转录与表达以及炎症因子释放的影响。方法:以LPS感染体外培养的小胶质细胞,将培养后的小胶质细胞分为四组:37℃-NS组(正常对照组)、37℃-LPS组、33℃-NS组和33℃-LPS组,于感染后的0h、2h、6h、12h和24h各时间点收集各组细胞和细胞培养上清,同时以不同温度下的未感染细胞作为正常对照组。○1用TRIzol提取细胞中RNA,通过实时定量PCR检测小胶质细胞中TLR4、NF-κB m RNA转录水平。○2用免疫印迹法(Western-blot)法检测各组细胞中TLR4、NF-κB蛋白的表达水平,○3用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素10(IL-10)的水平。○4用MTT法检测各组细胞增殖情况。所得数据均经统计学软件分析。结果:1.37℃-LPS组:随着诱导时间的延长炎症因子TNF-α、IL-10的含量逐渐升高;在LPS介导的小胶质细胞的不同时间点,可上调TLR4、NF-κB基因转录水平表达,且其表达量均随时间的延长逐渐升高;且细胞中TLR4、NF-κB蛋白含量表达均与LPS刺激之间有时间依赖性关系;2.33℃-LPS组:随着诱导时间的延长炎症因子TNF-α、IL-10的含量逐渐升高,但与常温LPS组相同时间点上清液中炎症因子的含量比较明显降低(TNF-α:2h:P<0.01;6h:P<0.01;12h:p<0.0001;24h:P<0.0001。IL-10:2h:P2<0.05;6h:P<0.005;12h:P<0.0001,24h:P<0.0001);在细胞中的TLR4、NF-κB基因转录水平表达有所下降,有统计学意义(TLR4 m RNA:0h:P=0.4496;2h:P<0.0001,P2<0.01;6h:P<0.0001,12h:P<0.0001,24h:P24<0.005;TLR4蛋白:0h:P=0.0763,2h:P<0.01;6h:P<0.01;12h:P<0.01;24h:P<0.0.01;NF-κB m RNA:0h:P=0.9048;2h:P=0.0001;6h:P=0.001;12h:P=0.0001;24h:P=0.0001;NF-κB蛋白:0h:P=0.1277,2h:P<0.01;6h:P<0.05;12h:P<0.01;24h:P<0.001),且其表达量与诱导之间仍有时间依赖性;细胞中TLR4、NF-κB蛋白含量在检测时间段内随时间的延长逐渐升高,但与常温LPS组相同时间点比较其值明显降低的,有统计学意义(P<0.05)。3.对照组:常温及亚低温对照组的炎症因子TNF-α、IL-10的含量在相同时间点没有统计学意义(P>0.05);不同温度下的对照组细胞中Toll4、NF-κB基因转录水平和蛋白含量在相同时间点之间没有统计学意义(P>0.05);正常对照组所检测的数值与LPS组在相同时间点比较明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:在常温条件下,LPS刺激小胶质细胞触发氧化应激反应,使TLR4及其下游分子NF-κB的表达上调,促炎因子TNF-α在早期明显升高,抗炎因子IL-10的含量增加相对缓慢;在亚低温条件下,LPS诱导的小胶质细胞表达TLR4及其下游分子及释放炎症因子的含量在不同时间点表现为持续升高,但与常温LPS组相同时间点比较明显降低,具有统计学意义(P<0.05)。表明亚低温可以通过下调小胶质细胞TLR4/NF-KB信号分子的表达,减少促炎因子TNF-α的释放,对抗炎因子IL-10水平影响相对较小,使炎症反应趋于正向平衡,最终达到脑保护作用。
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