【摘 要】
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研究目的:探索溶瘤痘苗病毒S6稳定扩增的剂量条件和时间条件,达到溶瘤痘苗病毒高效的生产,以获得稳定的滴度,满足后续的实验需求。研究方法:1)首先将20μl、40μl、60μl、80μl、100μl的溶瘤痘苗病毒S6接种到He La细胞中,通过比较上述不同剂量组的平均荧光强度和感染率来选择适合的接种剂量;2)将20μl的溶瘤痘苗病毒S6接种到相同密度的He La细胞中,通过比较12h、24h、36h
【基金项目】
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广西壮族自治区自然科学基金（2018GXNSFAA138061）； 南宁市科学研究与技术开发计划项目（20183203-3）；
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研究目的:探索溶瘤痘苗病毒S6稳定扩增的剂量条件和时间条件,达到溶瘤痘苗病毒高效的生产,以获得稳定的滴度,满足后续的实验需求。研究方法:1)首先将20μl、40μl、60μl、80μl、100μl的溶瘤痘苗病毒S6接种到He La细胞中,通过比较上述不同剂量组的平均荧光强度和感染率来选择适合的接种剂量;2)将20μl的溶瘤痘苗病毒S6接种到相同密度的He La细胞中,通过比较12h、24h、36h、48h、60h的平均荧光强度和感染率来选择最佳收获时间,采用空斑实验比较不同收获时间的溶瘤痘苗病毒S6的病毒滴度,进一步对优化后的病毒扩增条件进行验证。研究结果:第36小时初始接种剂量20μl的溶瘤痘苗病毒S6和40μl、60μl、80μl、100μl组的初始接种病毒剂量组相比,其平均荧光强度和感染率差异无统计学意义（P＞0.05）,因此选择20μl的初始病毒剂量用于下一步条件探索。以20μl为初始接种剂量于12h、24h、36h、48h、60h的平均荧光强度和感染率差异有统计学意义（P＜0.05）,在48小时达最高,初步推测48小时这个时间点是合适用来收获病毒的时间点,空斑实验检测结果第60小时收获的病毒滴度约为10~5 PFU,第48小时收获的病毒滴度约为10~6PFU,这2个时间点收获的病毒滴度比较差异有统计学意义（P＜0.05）。因此第48小时收获的病毒滴度更高。研究结论:通过剂量优化和时间优化后,20μl的初始病毒剂量在感染后第48小时收获的病毒滴度最高,优化后的病毒滴度可以提高5-10倍,最终可以稳定在10~6PFU的范围。研究目的:探讨溶瘤痘苗病毒S6对大量白细胞群体中的膀胱癌细胞的识别能力以及从膀胱癌患者血液样本中标记循环肿瘤细胞的可能性,以期为膀胱癌患者的临床诊治提供一个辅助手段。研究方法:细胞计数仪评估膀胱癌细胞与白细胞的大小差异,荧光显微镜下评估溶瘤痘苗病毒S6对人膀胱癌T24细胞各时间点的感染率和平均荧光强度,流式细胞仪检测膀胱癌细胞和白细胞的感染情况,高内涵分析仪评估溶瘤痘苗病毒S6对膀胱癌细胞和白细胞的感染情况,荧光显微镜下定性评估溶瘤痘苗病毒S6对大量白细胞群体中T24膀胱癌细胞的识别能力,使用其余3种膀胱癌细胞RT4、UMUC3、SW780对定性评估结果进行验证,高内涵细胞成像系统对膀胱癌患者血样中的循环肿瘤细胞进行识别,从而推断使用溶瘤痘苗病毒S6对检测膀胱癌患者的循环肿瘤细胞可行性。研究结果:膀胱癌细胞与白细胞大小比较,差异有统计学意义（P＜0.05）,在荧光显微镜下评估溶瘤痘苗病毒S6对T24细胞在12h、16h、20h、24h各时间点的感染率和平均荧光强度（P＞0.05）,差异无统计学意义,但平均感染率和平均荧光强度在16小时略高于12小时,流式细胞仪检测膀胱癌细胞的感染率约70%,在白细胞群体有很强的红色荧光信号干扰。高内涵成像分析系统显示溶瘤痘苗病毒S6在白细胞群体未见明显表达红色荧光蛋白的细胞,高内涵成像分析系统下评估膀胱癌细胞的感染率和感染谱,在MOI为1时对T24细胞最高可达80%以上的检出限,对T24细胞MOI为2时最高可达90%以上检出限,2组比较差异有统计学意义（P＜0.05）,在MOI为1时溶瘤痘苗病毒S6对膀胱癌细胞T24、UMUC3、SW780、RT4感染率比较,差异有统计学意义（P＜0.05）,在荧光显微镜下可以鉴别直径大于白细胞群体且表达红色荧光蛋白的膀胱癌细胞,高内涵成像分析系统和荧光显微镜的检测结果显示使用溶瘤痘苗病毒S6在2例膀胱癌患者4ml血液样本中可以检出表达红色荧光蛋白的细胞,初步认为表达红色荧光蛋白的细胞可能为CTC.其中1例患者的4ml血样已由CellomicsTM检测出3个CTC,其中1个CTC为间质特性,另2个CTC为上皮性质的。研究结论:溶瘤痘苗病毒S6对膀胱癌细胞可达较高的检出限,最高可达80%以上,在白细胞中未见明显表达红色荧光蛋白的阳性细胞,增加病毒剂量可以增加膀胱癌细胞的感染率,则对白细胞几乎不影响,初步判断使用溶瘤痘苗病毒S6可能用于检测膀胱癌患者的血液样本中循环肿瘤细胞,使用溶瘤痘苗病毒S6检测循环肿瘤细胞是有前途的。
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