猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)感染是一种严重危害养猪业的病毒性疾病，广泛分布于世界各地，至今尚未得到有效的控制。因此研制有效疫苗来防制本病依然是一项十分紧迫的任务。 NS1蛋白是PPV的非结构蛋白之一，由NS1基因编码。NS1蛋白对PPV早期和晚期的基因转录都发挥着重要的调节作用。由于病毒灭活后不表达NS1蛋白，利用该蛋白作为诊断抗原可以区分灭活疫苗免疫猪和野毒感染猪。本实验室在1999年从污染了猪细小病毒的PK15细胞系中分离得到了一株PPV，定名为SY-99株。以SY-99株的基因组DNA为模板，利用PCR扩增出了NS1基因，将其克隆到原核表达载体pET28a中，获得重组质粒pET28a／SYNS1。序列测定结果显示，NS1基因全长1989核苷酸，编码662个氨基酸。在推导的氨基酸序列中含有在PPV复制过程中发挥重要作用的保守基序GKRN，并有三个潜在的糖基化位点，分别位于356-359、446-449和513-516位氨基酸。序列比较表明，SY-99株与NADL2-1株、NADL2-2株和Kresse株NS1基因的核苷酸同源性分别为98％、99％和99％，氨基酸同源性分别为97％、99％和99％。将重组质粒pET28a／SYNS1转化到大肠杆菌BL21(DE3)株中，所得的重组菌株经IPTG诱导后，表达出高水平的NS1蛋白，表达率可达17.8％。经ELISA和Western Blotting检测，表达的重组蛋白具有免疫学活性。经过优化选择确定了NS1蛋白高效表达的最适参数。表达产物带有组氨酸标签，适于用His·Bind柱亲和纯化。重组NS1蛋白为制备PPV诊断抗原用于本病的流行病学调查提供了一种检测工具。 当前用于PPV免疫防制的疫苗主要是油乳剂灭活苗和冻干弱毒苗，这两种常规疫苗都存在一定的缺陷，如生产疫苗所用的猪源传代细胞系或原代细胞很容易污染其它病原，PPV的体外培养滴度低，难于生产出高效价的疫苗，而且弱毒疫苗还存在毒力返强的可能，所以研制新型疫苗十分有必要。PPV VP2蛋白可以形成病毒样粒子(vires-like particles，VLPs)，其免疫原性与PPV病毒粒子近似，可以使接种动物获得保护性免疫。因此本研究拟用体外表达的重组VP2蛋白作为预防PPV的候选亚单位疫苗。以SY-99株基因组DNA为模板，用PCR扩增得到了VP2基因，将其克隆到酵母表达载体pPICZαB中，经测序后与PPV参考毒株NADL-2株进行序列比较，结果表明二者同源性达99.2％。经定点突变后，VP2基因中的SacI位点被缺失，构建了重组酵母转移载体pPICZαB／mVP2，经SacI线性化后，导入酵母受体菌GS115中，经甲醇诱导培养后，用SDS-PAGE检测重组菌株裂解产物，结果未检出目的蛋白条带。然后将VP2基因克隆到了另一酵母表达载体pPIC9K中，构建了酵母转移载体pPIC9K／mVP2，经转化和诱导培养后，也未检测目的条带。我们又将VP2基因靠近5，端部分进行了序列改造，构建了酵母转移载体pPICZαA／MVP2，转化酵母受体菌后诱导培养，检测结果显示，VP2仍然没博土学位论文 摘 要 东北农业大学有得到成功表达。在利用酵母表达 PPV VPZ的试验研究中，我们均得到了含有重组子的阳性酵母菌株，我们对酵母生长条件进行了变化摸索，但在SDS－PAGE胶上始终没有肉眼可见的目的条带。所以我们初步推测SY－99株WZ基因中存在不适于在酵母体系表达的某种元件，抑或表达量过低而难于检测。 作为一种新型疫苗，基因疫苗具有安全可靠、生产简单、储运方便等优点，可望克服常规疫苗的某些不足。我们将猪细小病毒VPZ基因及猪Y－干扰素（IFN－Y）基因同时克隆到真核表达载体pIRESlneo中，构建了共表达VPZ和IFN－Y的基因免疫质粒pIRESI／VPZ／Y，用此表达质粒单独或加入脂质体肌注接种 BABUC小鼠，三次兔疫后，采取接种鼠血清，用ELISA检测特异性抗体，结果表明，脂质体可以加强表达质粒接种小鼠的兔疫应答水平，为今后研制猪细小病毒基因疫苗提供了依据。