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玉米赤霉烯酮是一类主要由禾谷镰刀菌产生的具有致癌作用的次级代谢产物,它能污染许多经济作物并引起全世界的食品和饲料安全问题,从而带来巨大的经济损失。如何安全有效的对污染的粮食或饲料进行脱毒处理,一直是一个比较棘手的问题。传统物理脱毒和化学的脱毒方法操作性较差,容易破坏粮食的营养成分,也容易引入二次污染。生物降解去除毒素具有反应条件温和、无有害试剂残留的优点,受到人们的青睐。本研究在前人研究的基础上,以zlhy-6为目标基因,对p AO815和外源基因进行改造和构建,以得到高效分泌玉米赤霉烯酮降解酶的工程菌,并对降解酶的性质进行了研究,得出如下结论:1.ZEN降解酶基因zlhy-6根据毕赤酵母基因密码子偏好性优化,经优化的序列前端引入α信号肽编码序列后,送公司利用化学方法合成。通过反复酶切酶连的方法,利用毕赤酵母表达载体p AO815构建含不同拷贝zlhy-6的重组表达载体,重组质粒转入大肠杆菌TOP10,经抗性筛选,对阳性克隆进行酶切鉴定,证明重组质粒构建成功。经过酶切鉴定,我们得到了重组表达载体p AO815-α-zlhy-6、p AO815-(α-zlhy-6)2、p AO815-(α-zlhy-6)4、p AO815-(α-zlhy-6)6,分别含1、2、4、6个zlhy-6拷贝。2.得到的一系列重组载体线性化后电击转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺陷型平板、SDS-PAGE筛选阳性转化子。并且通过SDS-PAGE比较不同转化子的蛋白表达情况,对转化子发酵液酶活进行比较,以得出ZEN降解酶分泌量最高、酶活力最高的转化子。不同拷贝转化子中以p AO815-(α-zlhy-6)4转化子蛋白分泌量最高,相应具有较高的降解ZEN能力,发酵液中酶活力达10 U/m L。3.用p AO815-(α-zlhy-6)4转化子上清液进行酶活性试验,反应1 h,重组酶对水溶液中20μg/m L ZEN的降解率可达到99%以上;用发酵液处理含2 mg/kg ZEN的玉米碴,当酶添加量为0.5 m L/g(V/W)时,玉米碴中的ZEN降解率达到75.51%左右;发酵液处理污染ZEN的玉米蛋白粉时,当酶添加量为2 m L/g(V/W)时,样品中ZEN的降解率达到了92.4%。4.进一步研究了温度、p H、金属离子等对酶活性的影响。明确了该酶的最适反应温度为37℃,最适反应p H为8。Li+及Mg2+对该酶有激活作用,Cu2+、Mn2+、Co2+、Ca2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+、EDTA等对该酶有抑制作用。5.采用化学修饰的方法对ZEN降解酶的功能基团进行探究,结果表明该酶的活性中心与丝氨酸和赖氨酸密切相关。本研究结果为玉米赤霉烯酮降解酶的工业化生产,降低ZEN的危害,保障粮食和饲料安全提供一定的技术支持。