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玉米(Zea mays L.)异交不亲和是玉米自交与正交亲和,而反交不亲和的一种雌雄配子互作现象。高等植物传粉受精是一个复杂的生理生化过程,从花粉粒在柱头上的识别、吸水、萌发、穿过柱头和花丝,到花粉管进入子房和胚囊,最后释放精细胞并和卵细胞受精结合。花粉与花柱胞间互作调控细胞的命运、形态与迁移模式:花粉与亲和柱头的表皮细胞外基质结合后,花粉管萌发穿透柱头;在花柱传导束中接受其引导、营养而快速伸长。这些过程通过胞间表面分子的信号交流,起始细胞内的信号级联反应,从而调控细胞核内基因的表达。因而花粉与花柱互作过程是研究胞间互作的理想模型。Ga1-S异交不亲和突变体,是研究上述过程中基因表达和调控的理想材料。目前国内外既没有报道与Ga1-S紧密连锁的分子标记,也没有报道Ga1-S的精确遗传定位,对于玉米花丝转录组蛋白质组的研究也未见报道。本研究首先观察花粉与花丝的互作过程,确定玉米Ga1-S异交不亲和发生的组织部位与时期;其次从遗传学的角度,利用回交群体构建Ga1-S的遗传图谱,为Ga1-S的分子标记辅助选择以及最终克隆Ga1-S奠定坚实的基础;最后通过转录组与蛋白质组学的分析,初步揭示异交不亲和的机理。本研究获得的主要试验结果如下:1异交不亲和的表型鉴定:对401D自交(GG×GG)、401D对W22授粉正交(gg×GG)、W22对401D授粉反交(GG×gg)组合,3个组合每个组合100个植株的结实情况进行定性调查,结果表明,401D自交(GG×GG)、正交(gg×GG)两个组合正常结实,只有反交(GG×gg)组合没有籽粒,表明异交不亲和基因Ga1-S的遗传效应在近等基因系中一致,401D异交不亲和性彻底。利用荧光显微镜观察,结果表明ga1型花粉管在Ga1Ga1型花柱中的伸长受阻,部分花粉管的顶端苯胺蓝染色加深,发生胼胝质积聚、膨大。2小时前,三组合的差异不显著;2小时后自交与正交花粉管的平均伸长速度为10mm/h;2小时后反交花粉管的平均伸长速度为2.5mm/h,最长至5cm左右;确定玉米Ga1-S基因异交不亲和发生的时间段是授粉后2~10 h,ga1型花粉管能够在Ga1Ga1型花柱传导束中伸长,但2 h后与对照相比伸长速率减缓,10 h后与对照差异显著,20 h后开始部分降解,最终不能达到花丝基部。2构建回交群体BC1F1(W22// W22/401D),通过结实性调查进行表型鉴定,173个单株中可育的有85株,不育的有88株,统计分析表明符合孟德尔回交群体1:1遗传分离规律,进一步验证异交不亲和基因Ga1-S为主效显性单基因;遗传群体的基因型鉴定,首先利用玉米第4号染色体上现有的SSR标记,筛选出5个与Ga1-S连锁的标记,Ga1-S基因初步定位于umc2410与umc1294之间;其次利用生物信息学工具在初定位区间内的BAC上逐一开发新的SSR标记,最终将玉米异交不亲和基因Ga1-S定位于玉米4号染色体短臂标记AC184840-2与AC184772-1之间,所有分子标记与Ga1-S基因的可能排序为由玉米4号染色体短臂近着丝粒一侧起依次为umc1682、umc1164、umc1758、umc2410、AC184840-2、Ga1-S、AC184772-1、umc1294。在标记AC184840-2与AC184772-1区段内有11 BACs (AC184840, AC194254, AC203042, AC191393, AC184113, AC180823, AC205353, AC214441, AC196002, AC210943, AC184772).3利用高通量测序数字表达谱,比较授粉后5小时的自交(GG×GG)与反交(GG×gg)花丝的转录组表达谱,并进行了荧光定量RT-PCR的验证。结果表明641个基因表达上调,737个基因表达下调;差异基因功能富集于分子结构调节活性,包括66个基因,其中31个基因表达上调,35个基因表达下调,它们主要参与信号转导、细胞运输、细胞组织等过程;并从中筛选出17个可能与异交不亲和相关的候选基因,它们包括Mitochondrial carrier-like protein、Nucleic acid binding protein、Ubiquitin fusion protein、CIPK-like protein、containing leucine-rich repeat receptor-like protein kinase、RALF precursor等基因。差异表达基因的基因组位置信息与遗传定位区段相比较分析,结果表明位于定位区段的候选转录本有GRMZM2G113470(9.8M)、GRMZM2G403636(7.2M)、GRMZM2G456471(6.8M);这些基因的染色体位置与功能有待于进一步研究。4利用双向电泳和质谱分析,首先比较研究了授粉后10 h自交(GG×GG)与反交(GG×gg)母本(GG)花丝蛋白质组的特异表达差异。结果表明自交与反交母本(GG)花丝蛋白质组共检测到25个差异蛋白质点,其中15个在自交中特异表达,10个在反交中特异表达;通过MALDI-TOF-MS质谱测序和MASCOT序列分析,注释了12个蛋白质点;其中自交中特异表达的蛋白质点11、12、14和异交中特异表达的蛋白质点18、22、24可能与玉米异交不亲和密切相关。候选蛋白11,功能注释为玉米的SGNH脂酶,其反应底物很多,如复合多糖、磷脂、酰基辅酶A酯等,已有研究表明其参与细胞壁的角质化过程、花粉水化过程、调节小穗的发育、降解细胞壁多糖促进细胞的生长与伸长。蛋白质组与遗传定位比较分析表明,被注释的差异蛋白质的基因组位置信息与与遗传定位区段相比较分析,结果表明被注释差异蛋白质都不位于定位区段内。其次比较母本(GG)自交授粉后1 h和2 h的花丝蛋白质组的差异。结果表明:与授粉1 h的蛋白组相比,在授粉2 h后的蛋白组中出现28个差异蛋白点;在玉米花粉与花丝早期的相互作用过程中蛋白质组有显著的变化;其中,6个蛋白质点特异表达,19个蛋白质点上调表达,3个蛋白质点下调表达;通过MALDI-TOF-MS质谱测序和MASCOT序列分析,注释了23个蛋白质点,其余5个为未知蛋白;功能分类表明,差异蛋白质分别参与细胞壁合成(21.4%)、防御/抗胁迫(17.9%)、细胞组织、蛋白命运、蛋白合成、转录等细胞过程。授粉2 h和1 h相比,蛋白质组中大部分差异蛋白呈上调趋势,并有特异蛋白质出现;分泌型过氧化物酶、膨胀素、果胶甲基化酶抑制蛋白、谷胱甘肽转移酶与未知蛋白4可能与玉米花粉与花丝的早期互作密切相关。β-7-膨胀素可能参与松弛柱头与花柱的细胞壁,促进花粉管的延伸。果胶甲基化酶抑制蛋白与果胶甲基化酶相互作用,可能通过调整细胞壁的结构和组分,调控花粉管的生长。柱头特异性的过氧化物酶(SSP),其具有细胞专一性和特定的表达模式,在柱头表皮细胞的细胞质中和细胞表面特异的表达。成熟花柱柱头的过氧化物酶活性显著增高,并在花柱发育到最易接受花粉时达到最高值,这一现象已被用来判断花柱的成熟程度。分泌型的过氧化物酶Ⅲ在棉花的生殖器官中特异表达,与花粉在柱头上的萌发期相比,在花粉管的伸长早期呈上调趋势。