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背景与目的结直肠癌具有发病率高、早期诊断率低、术后容易复发等特点,严重危害人们的生命。目前,传统手术切除、放疗、化疗是结直肠癌的主要治疗手段,但这些手段均缺乏特异性,易产生副作用,致使患者死亡率居高不下。因此,对结直肠癌分子发病机制及诊治新技术、新疗法的研究尤为重要和迫切。随着分子生物学的飞速发展,基因靶向治疗已成为未来最有希望治疗恶性肿瘤的方法之一。因此,研究结直肠癌细胞恶性转化过程相关基因及其功能,分析基因间相互关系将有助于其临床治疗。研究表明,细胞恶性转化相关基因——膜联蛋白A2(AnnexinA2,ANXA2)在人结直肠癌组织/细胞高表达,且与癌细胞的增殖、浸润、迁移等恶性行为密切相关,可作为结直肠癌血清标志物。本实验拟通过RNAi技术下调ANXA2在人结直肠癌caco2细胞内表达,分析AXNA2表达与caco2细胞凋亡的关系；并研究ANXA2表达下调对其部分相关基因(S100A10、FAK、tPA、 β-actin)表达的调节,分析基因间相关性,探讨以ANXA2作为靶基因进行结直肠癌基因治疗的可能性,为肿瘤的基因治疗提供实验资料与证据。方法1. Gene Bank查寻ANXA2相关信息,依据引物设计原则设计靶向ANXA2的干扰序列和错义对照序列,将其克隆至质粒表达载体pU6H1-GFP构成重组质粒。2.采用S-TranG转染方法,将ANXA2干扰质粒和错义对照质粒转入人结直肠癌caco2细胞,同时设野生组作为阴性对照；转染后60h检测细胞内GFP表达量,以此评估转染效率和ANXA2抑制水平。3. Mito View633染色caco2细胞,利用流式细胞仪检测各组细胞凋亡水平,判断其凋亡趋势。4. Hoechst33258、MitoView633分别染色caco2细胞,利用倒置荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜观察各组细胞细胞核形态变化以及线粒体膜电位变化。5.分别以半定量RT-PCR、Western Blot检测转染96h后的各组细胞部分ANXA2相关基因的mRNA与蛋白表达水平,分析相关性。结果1.设计、合成了4条不同的靶向人ANXA2基因的siRNA序列和一条错义对照序列,并成功构建成重组质粒；本实验选用ANXA2抑制效果最好的1号质粒和错义对照重组质粒进行实验。2.优化的S-TranG转染条件：转染前细胞融汇率70%左右,450μl复合物体系包含S-TranG试剂10μl,质粒6μg和PBS,15min沉淀复合物形成时间,1ml DMEM培养基混匀,加入30mmm细胞培养皿,5%CO2、37℃孵育,6-7h后再补充1ml DMEM。3.转染60h时细胞内GFP表达量80%以上,表明ANXA2表达被有效抑制。4.流式细胞仪检测结果显示ANXA2表达被抑制细胞线粒体的着色荧光强度明显降低(p<0.05),表明其线粒体正常膜电位发生改变,提示凋亡趋势。5.形态学检测结果表明ANXA2表达被抑制细胞出现了较为明显的凋亡样特征。6.半定量RT-PCR、Western Blot检测部分ANXA2相关基因结果显示：沉默ANXA2表达后,S100A10和tPA表达随之下调,而FAK和β-actin表达没有明显变化。结论通过RNAi技术可有效下调结直肠癌caco2细胞ANXA2表达,caco2细胞内ANXA2表达能在一定程度上抗细胞凋亡而促进其生长；同时能通过不同的方式调节与癌细胞浸润、转移相关的部分基因的表达与功能。因此,ANXA2具有成为人结直肠癌基因治疗新靶点的潜在性。