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旋毛虫是分布最广泛的寄生虫之一,可感染人及150多种哺乳动物,引起的旋毛虫病是一种严重的人兽共患病。旋毛虫病呈世界性分布,被认为是再度肆虐的疾病,若不及时诊断和治疗,患者的死亡率可达3%-30%。人类主要因生食或半生食猪肉而感染,故为预防人体旋毛虫病,对猪肉的旋毛虫检疫非常重要,否则,不仅严重危害人体健康,还对养猪业及肉类出口造成巨大的经济损失。随着我国加入WTO后国际贸易的增多,每年将有大量动物肉类进出口,猪肉在肉类进出口中占有很大比重,因此,我国亦有可能出口或从国外进口含有旋毛虫的动物肉类及肉制品,从而影响我国的肉类贸易信誉或从国外输入旋毛虫病。但目前尚无用于肉类及肉制品中旋毛虫的特异性快速检疫方法。国内常采用膈肌压片显微镜检查,时有漏检现象发生,酶联免疫吸附试验(ELISA)在国内外均已试用于生猪屠宰前的旋毛虫病检疫,但所使用的旋毛虫幼虫可溶性抗原、排泄分泌(ES)抗原及单抗纯化抗原,或因抗原成份复杂、或虫体来源困难难以大量制备及抗原制备难以标准化等因素影响了血清学方法检疫旋毛虫的发展和推广应用。随着分子生物学技术的发展及其在寄生虫学上的广泛应用,基因重组抗原由于可大量制备、特异性好等优点,有希望用于肉类及肉制品中旋毛虫的检疫。从旋毛虫(T1)、北方旋毛虫(T2)及南方旋毛虫(T7)中鉴定出旋毛虫属特异性抗原,利用基因工程技术生产出基因重组抗原,能够解决天然虫体抗原来源的困难,即可用于多种旋毛虫引起的旋毛虫病的诊断,又可对肉类及肉制品中的多种旋毛虫进行检疫。因此,本文应用免疫印迹对T1、T2、T7的肌幼虫可溶性抗原及ES抗原进行了分析,并对1种属特异性共同抗原(53kDa)进行了基因克隆和序列分析,为53kDa抗原的表达和应用奠定了基础。第一部分:三种旋毛虫属特异性抗原的鉴定材料和方法制备3种旋毛虫(T1、T2、T7)的可溶性抗原和ES抗原,测定各种抗原的蛋白2004届郑州大学硕士研究生论文浓度,将各种抗原进行SDS一队GE分析,银染后可看到各种不同的电泳带。然后进行Westem blot分析,鉴定3种旋毛虫的属特异性共同抗原。结果1.旋毛虫肌幼虫可溶性抗原的SDS一PAGE结果:T1、TZ、T7三种旋毛虫可溶性抗原显示的蛋白条带大致相似,相同的蛋白条带为112、108、97、94、69、58、55、53、49、45、43、39、37、34、32、29、25、22、21kDa,主带为66、53、42、3IkDao2.旋毛虫肌幼虫ES抗原的SDS一PAGE结果:T1、TZ、T7三种ES抗原有许多相同的蛋白带,分子量为160、113、108、53、48、43、35、32、29、22、16kDa。TI旋毛虫ES抗原主带为160、67、58、48、43、35、22 kDa;TZ旋毛虫ES抗原中160、91、43、38、35、29、22 kDa为主带;T7旋毛虫ES抗原主带为1 60、58、43、35 kDa。3.旋毛虫肌幼虫可溶性抗原及ES抗原的Westem blot结果:53 kDa蛋白组分为T1、TZ两种旋毛虫肌幼虫可溶性抗原及ES抗原中的属特异性共同抗原;Tl旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中的53 kDa蛋白组分还可与T7旋毛虫感染的小鼠血清反应。43kDa蛋白组分为Tl、TZ两种旋毛虫肌幼虫ES抗原中的属特异性共同抗原。未发现T1与T7的肌幼虫ES抗原之间及TZ与T7的肌幼虫ES抗原之间存在有属特异性共同抗原。结论1.53kDa蛋白组分为Tl、TZ两种旋毛虫肌幼虫可溶性抗原及ES抗原中的属特异性共同抗原。2.43kDa蛋白组分为Tl、TZ两种旋毛虫肌幼虫ES抗原中的属释异性共同抗原。3.Tl旋毛虫肌幼虫抗原中的53kDa组分可作为Tl、TZ、T7等3种旋毛虫感染引起的旋毛虫病的血清学诊断及肉类中3种旋毛虫检疫的候选抗原。第二部分:旋毛虫肌幼虫53 kDa抗原基因的克隆及序列分析材料和方法本实验登陆GenBank找到其编码蛋白的二级结构和BTl旋毛虫53kDa抗原的。DNA序列,利用生物软件分析细胞表位及信号肤区域后设计了一对巢式引物,通过RT一PcR扩增出53kDa抗原基因的大部分序列,并将其插入到克隆载体pucls中,经鉴定正确后,进一步与表达载体pET30a(+)连接,构建重组表达质粒pET3oa(+)一Ts53,对重组质粒进行鉴定,结果正确后测序,并通过生物软件对Ts53抗原基因进行序列分析和比较。2004届郑州大学硕士研究生论文结果1.旋毛虫53 kDa抗原的B细胞表位可能在第20一25、67一71、116一122、131一135、142一146、194一197、224一240、264一270、278一283及341一346位的氨基酸残基。2.旋毛虫53 kDa抗原最可能的信号肤切割位点位于第21和22位氨基酸(C Tc一sT)之间。3.通过酶切和特异性PCR鉴定,表明重组质粒pUC18一Ts53和pET30a(+)一Ts53已成功构建。4.测序结果表明,所克隆的Ts53基因的核普酸片段为857bP,编码285个氨基酸;Ts53的核苔酸片段与GenBank中报道的序列相似性为99.06%,氨基酸的相似性为982%,发现有5个氨基酸改变(第32位:谷氨酸一甘氨酸;第44位:天冬酞胺一天冬氨酸;第76位:精氨酸一苏氨酸;第86位:蛋氨酸一苏氨酸;第263位:苯丙氨酸一丝氨酸)。结论1,首次应用生物信息学对旋毛虫的抗原表位进行了预测,为制作旋毛虫的B细胞优势短肤提供了理论依据。2.应用RT一PCR从旋毛虫肌幼虫总RNA中扩增出旋毛虫53 kDa抗原基因的大部分编码序列,并成功构建其重组