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猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS,俗称蓝耳病)是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)引起的一种严重危害养猪业的免疫抑制性疾病。疫苗接种是预防本病的重要手段之一。但是,由于PRRSV具有严格的细胞嗜性,原代易感细胞如猪肺泡巨噬细胞(PAM)等难以满足大规模生产的需求,而继代细胞如非洲绿猴肾上皮细胞(Marc145)等因缺乏唾液酸黏附素(Sn)受体限制了某些PRRSV田间流行株的体外增殖,这十分不利于现有PRRS疫苗免疫效果的持续性评价及其疫苗种子库的建立,阻碍了PRRS疫情的防控实践。故此,迫切需要构建PRRSV易感的重组细胞系来解决这一瓶颈性问题。【目的】本论文拟借助CRISPR/Cas9技术对Marc145细胞的基因组进行修饰和改造,构建稳定表达猪源Sn(p Sn)的Marc145细胞株(p Sn-Marc145),以期提高PRRSV的细胞吸附能力及其适应性和感染性,为PRRSV的基础与应用研究提供可靠的细胞平台支撑。【方法】本论文选择Marc145细胞第11号染色体RACGAP1和ASIC1基因之间的内含子序列作为打靶区域。首先,利用生物学软件设计单向导RNA(sg RNA)并构建Cas9打靶质粒,通过软件分析和Surveyor检测试剂盒筛选脱靶效率较低的sg RNA;并利用编码增强型绿色荧光蛋白(e GFP)的供体质粒进行同源重组修复,借助荧光显微镜观察、Junction PCR、Southern Blotting等方法来确定外源基因是否可以特异性重组至靶向区域并有效表达。随后,根据所选sg RNA,构建并比较不同Cas9突变体打靶质粒的切割效率;选择脱靶效率低、切割效率和同源重组较高的Cas9打靶质粒用于p Sn-Marc145细胞的构建:在CRISPR/Cas9系统的介导下,将p Sn基因序列经供体质粒整合至Marc145细胞基因组中。嘌呤霉素加压条件下,挑取单克隆细胞并扩大培养;对经Junction PCR、Southern Blotting、Western Blotting、间接免疫荧光试验鉴定为阳性的克隆进行核型分析、细胞形态观察以及生长周期活性评估。最终,在正常的Marc145和p Sn-Marc145细胞上,比对研究制苗用PRRSV(VR2332、CH1R、R98、JXA1)和野生型PRRSV(GSWW2018和GSKL)的生物学特性。【结果】本论文共设计合成了5种sg RNA(sg RNA-3、-17、-23、-24、-33),其中sg RNA-24的脱靶效率最低;该打靶质粒能够将供体质粒携载的e GFP定点整合于RACGAP1和ASIC1基因之间的内含子中并检测到特异性绿色荧光。3种Cas9突变体(p Sp Cas9、Cas9n、e Cas9)中,Cas9n(含双sg RNA)打靶质粒的切割效率最高;将Cas9n(含双sg RNA)打靶质粒和p Sn供体质粒转染正常的Marc145细胞后,获得了2株靶向单一整合的p Sn-Marc145重组细胞(24-15-7、24-15-9),单细胞阳性克隆在保持正常Marc145细胞遗传特征和细胞形态的同时,表现出更优的生长活性。通过蚀斑形成试验、间接免疫荧光试验、病毒生长曲线的绘制、Western Blotting和实时荧光定量PCR检测发现,尽管p Sn的表达对PRRSV疫苗生产用毒种在Marc145细胞中的毒力和复制能力影响不大,但显著提高高致病性PRRSV(HR-PRRSV,JXA1)的吸附能力;通过传代培养、遗传变异分析、实时荧光定量PCR、蚀斑形成试验和病毒生长曲线的绘制发现,2株野生型PRRSV在p Sn-Marc145细胞上具有明显强于其在正常Marc145细胞上的适应性和感染性。【结论】综上所述,本论文研究结果表明:一、Marc145细胞基因组中第11号染色体RACGAP1和ASIC1基因之间的内含子区域可作为外源基因定点打靶的有效位点。二、利用CRISPR/Cas9系统构建的p Sn-Marc145细胞株在HP-PRRSV疫苗生产和野生型PRRSV分离过程中具有良好的应用潜力。