研究背景根据2014年的报告估计,全球糖尿病患病率为8.3%,影响全球3亿8700万以上成年人,预计到2030年底数字将上升到55%,累及超过5亿9200万名患者。其中糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见的慢性并发症之一,也是全球终末期肾病(ESRD)最主要的死亡原因之一,严重影响了人类的生活质量。近年来氧化应激被认为是引起DN发生及发展共同的病理生理机制,其中氧化应激反应导致的肾小球足细胞损伤在DN进展中发挥的作用越来越受到重视。因此,在DN防治中,减少线粒体内的氧化应激作用引起了国内外学者的广泛关注,抗氧化疗法已然成为治疗DN的新方向。氧化应激是由促氧化和抗氧化系统失衡所致。正常状态下人体可产生少量活性氧(ROS)进行生理代谢,同时体内存在抑制自由基和清除自由基的反应体系,该体系使多余的自由基被清除,因此ROS的产生和清除始终达到动态平衡状态。如果这一动态平衡遭到破坏,则引起ROS的蓄积,导致一系列病理生理损伤,这一过程即为氧化应激。氧化应激过程中大量脂质和蛋白质氧化产物、活性醛类化合物、氧化修饰的巯基、羟基化合物等积聚。糖尿病时,体内过多的ROS通过直接损伤或作为第二信使,激活细胞内信号传递系统,诱导足细胞损伤。过度的氧化应激通过氧化作用破坏组织结构、干扰正常的组织功能、影响信号转导。研究提示糖尿病时肾脏存在明显的氧化应激状态,其通过P38/MAPK丝裂原活化蛋白激酶、TGF-β、MCP-1和caspase家族等促进足细胞的凋亡和丢失,从而引起肾脏结构和功能损害以及蛋白尿的产生,参与了DN发生及发展的多个环节。DN早期表现包括肾小球高滤过和尿微量白蛋白排泄增加,基底膜增厚、细胞外基质积聚、系膜增生和肾小球肥大。随着病程进展,产生大量蛋白尿,继而肾小球及间质硬化,最终发展为ESRD。以往着重于肾小球系膜损伤的研究,认为系膜基质的增多是DN发生的核心病变。然而近年来越来越多的研究提示,足细胞损伤是DN发病早期的重要改变,其对滤过屏障的完整性、蛋白尿的产生和肾小球硬化具有重大意义。线粒体是活性氧产生最主要部位,对氧化应激反应也最为敏感。肾脏是高能量代谢器官,线粒体含量丰富,线粒体功能失常在肾间质纤维化中可能起关键作用,近年受到广泛关注。在线粒体中,细胞色素C通过和心肌磷脂阴离子结合固定于线粒体内膜上。心肌磷脂仅存在于线粒体,其最早发现于线粒体内膜,有保持线粒体膜流动性和稳定性的作用。心肌磷脂和细胞色素C间的分子联系包括,C端氢键结合作用和疏水作用,A端的静电作用。大部分细胞色素C与线粒体内膜结合,当细胞色素C和心肌磷脂之间的静电作用、疏水作用和氢键结合作用被破坏,细胞色素C就会离开线粒体,进入胞浆。研究显示氧化应激减少了心肌磷脂和细胞色素C的结合力,同时心肌磷脂的抗氧化作用促进了细胞色素C在线粒体内膜的固定。细胞色素C在凋亡中释放过程分为两步。首先细胞色素C和线粒体内膜的心肌磷脂分离,接着通过线粒体外膜中Bax等的透化作用,释放到胞质中。越来越多的实验显示ROS促进细胞色素C与心肌磷脂分离,接着细胞色素C通过促凋亡蛋白在线粒体外膜中打开的孔道进入胞浆溶质。再灌注的兔心心肌缺血模型中ROS生成过多引起了心肌磷脂的氧化和变性,并伴随线粒体COX活力的下降。此外,在中毒神经元细胞的研究中发现,ROS介导了细胞色素C从线粒体中的释放。Bcl-2能调节线粒体膜对一些促凋亡蛋白的通透性,位于线粒体上游的Bax能调控一些小分子如细胞色素C等通过线粒体膜进入胞质,进一步激活下游caspase级联反应,从而引起细胞凋亡。实验表明细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤,其与caspase-9结合形成凋亡小体,同时激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3、caspase-7,其中caspase-3是caspase级联反应下游最关键的凋亡执行者。传统的抗氧化剂疗效欠佳,大多是因为这些化合物大量分布在细胞外或胞浆内,不能进入线粒体,难以发挥抗氧化作用。SS肽属于可渗入细胞的小分子多肽家族,其能够靶向定位和聚集在线粒体内膜上,清除细胞内ROS并抑制线粒体ROS的产生,从而防止线粒体通透性改变和细胞色素C的释放。研究显示对于糖尿病大鼠的视网膜损伤,SS-31能够有效的改善视网膜的氧化应激状态以及保护其结构的完整性。次氯酸修饰白蛋白(HOCl-alb)是氧化应激过程中形成的蛋白质氧化修饰产物,是1996年Witko-Sarsat及其同事首次在尿毒症血液透析患者血浆中检测到的,后来发现它们在糖尿病患者体内也有明显升高。在体外用次氯酸(HOCl)作用于人血清白蛋白同样可以得到与尿毒症患者血浆中类似的HOCl-alb. HOCl-alb不仅是氧化应激的产物和标志物,其作为强的促氧化应激和促炎症反应介质,研究已经较为充分,HOCl-alb能够诱导糖尿病大鼠巨噬细胞趋化浸润、MCP-1和TGF-β表达上调、ROS产生增加、蛋白尿以及肾小球病理性改变加重。但它是否能够通过线粒体相关的信号传递途径诱导或加重糖尿病肾病足细胞凋亡,尚不清楚。本课题采用链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠作为模型,验证我们的假设：糖尿病环境中,HOCl-alb通过诱导线粒体功能失常和细胞内活性氧产生,激活凋亡信号,诱导足细胞凋亡,导致肾小球基底膜屏障功能受损,最终导致蛋白尿发生和肾小球硬化。线粒体靶向抗氧化剂SS-31可能通过阻断线粒体氧化应激损伤,抑制HOCl-alb对足细胞的促凋亡通路,减少足细胞的丢失和蛋白尿的形成,从而起到预防或延缓糖尿病肾病进展的作用。材料和方法一.体外制备无内毒素HOCl修饰的大鼠血清白蛋白(HOCl-RSA)及其鉴定：采用Witko-Sarsat等介绍的方法。将无内毒素的RSA溶液与次氯酸溶液按照1：140摩尔比混合,室温放置30分钟。制备的HOCl-RSA在4℃无内毒素磷酸盐(PBS)缓冲液中透析24小时,以除去游离的次氯酸。用0.22μm一次性针头滤器过滤除菌,分装后4℃保存。将无内毒素的RSA溶液与无菌PBS等体积混合,作为对照。试验中所有玻璃器皿均放入180℃烤箱4小时以去除内毒素。含量测定以不同浓度氯胺T为标准品制作标准曲线,测定酸性条件下340nm处的吸光度值。所制备的HOCl-RSA中HOCl-alb含量为5.14±0.25nmol/mg蛋白,未修饰的RSA中HOCl-alb含量为0.21±0.05nmol/mg蛋白。采用鲎试验法测定制备的HOC1-RSA内毒素含量,并证实内毒素水平低于0.025EU/ml。二.SS肽的合成和进入线粒体的鉴定1.SS肽的合成SS肽由杭州中肽公司协助合成,SS肽氨基酸序列和化学结构如下：SS-02(Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2, Dmt=2’,6’-dimethyltyrosine), SS-31 (D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2).2.线粒体提取取肾组织(皮质),按照试剂盒说明书提取线粒体。3.SS肽体外进入线粒体的鉴定用固相法合成SS-02(Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2, Dmt=2’,6’-dimethyltyrosine),用[3H]标记SS-02,采用液体闪烁计数仪进行在线粒体中定位的实验研究。结果显示,SS-02分布于线粒体外膜约20-30%,线粒体内膜约50%,线粒体基质20-30%。三.糖尿病模型的制备和分组1、模型制备成年雄性SD (SpragueDawley)大鼠,购于南方医科大学实验动物中心,体重180-220g,在恒温SPF级环境(南方医科大学SPF级实验动物中心)饲养,自由进食及饮水。禁食16小时后单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ) 60mg/kg(溶于0.01mol/L柠檬酸缓冲液,PH4.5,现配现用),72小时后剪尾取血,用电子血糖仪测量血糖,血糖值>16.7mmol/L作为糖尿病(DM)动物模型。2、实验动物分组①正常大鼠对照组1：尾静脉注射PBS,1次/日；②正常大鼠对照组2：尾静脉注射未经修饰的大鼠白蛋白：RSA 40mg/kg,1次/日；③DM大鼠RSA注射组：尾静脉注射未经修饰的大鼠白蛋白：RSA 40mg/kg,1次/日；④DM大鼠HOCl-RSA注射组：尾静脉注射HOCl修饰的大鼠白蛋白:HOCl-RSA 40mg/kg,1次/日；⑤DM大鼠SS-31干预组：腹腔注射3mg/kg SS-31,1次/日；⑥DM大鼠HOCl-RSA注射及SS-31干预组：尾静脉注射HOCl-RSA 40mg/kg,1次/日；同时给予腹腔注射3mg/kg SS-31,1次/日；3、标本留取于分组后进行大鼠干预16周,取标本前一天将大鼠放于代谢笼中留取24小时尿并记录尿量,离心20分钟(4℃ 3000rpm),分装后-70℃冰箱冻存。将大鼠充分麻醉后固定于鼠板上,腹主动脉取血,EDTA-K2抗凝管收集血标本,30min内离心15分钟(4℃3000rpm),留取血浆,分装后-70℃冻存。4℃生理盐水灌注腹主动脉至肾脏苍白色,以去除循环中的红细胞,迅速摘取左右侧肾脏,分离肾皮质和髓质,留取皮质。四.检测指标1.生化指标：血浆及尿液标本用全自动生化分析仪检测血糖(GLU)、白蛋白(ALB)、微量白蛋白(mALB)、血肌酐(SCr)、尿肌酐(SCr),并计算内生肌酐清除率(CCr),CCr (ml/min/kg)=尿肌酐／血肌酐/24h(1440min)×24小时尿量／大鼠体重。2.肾皮质匀浆、血浆HOCl-alb浓度检测：采用分光光度法。3.尿8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)定量：应用商品化的ELISA试剂盒检测。4.病理组织学观察：肾皮质经固定、脱水、石蜡包埋,4gm切片,行PAS及Masson染色。5.足细胞凋亡的变化：冰冻切片TUNEL荧光标记法计数凋亡的足细胞6. Western Blotting检测相关蛋白：肾皮质匀浆,提取总蛋白,检测caspase-3, caspase-7, caspase-9, WT-1和PARP-1表达；肾皮质匀浆,分别提取线粒体蛋白和胞浆蛋白,检测Cytochrome C表达。7.免疫组织化学计数肾小球足细胞数目：肾皮质经固定、脱水、石蜡包埋,4μm切片,Wilms’ Tumor (WT-1)染色肾小球足细胞核,计算足细胞数目。结果一、大鼠物理和生化指标变化：1、体重糖尿病组大鼠体重均较正常组对照组①、②下降(①623.72±21.20,②619.23±23.47 vs③249.62±29.11,④173.35±27.60,⑤310.14±32.75,⑥241.38±27.29,P均<0.001),注射HOCl-alb及干预性SS-31治疗均对体重无显著影响(P>0.05 vs组③)。2、血糖糖尿病组大鼠血糖均高于正常组对照组①、②(①5.6±0.8,②5.8±1.0 vs③29.78±2.51,④31.46±3.23,⑤32.34±2.76,⑥30.40±2.48,P均<0.001),证明糖尿病大鼠成模,而注射HOCl-alb及干预性SS-31治疗均对血糖无显著影响(P>0.05 vs组③)。3、尿白蛋白排泄量糖尿病组大鼠24小时尿蛋白定量高于正常对照组①、②(①0.19±0.05,②0.21±0.03,③0.34±0.09,④0.51±0.10,⑤0.27±0.08,⑥0.30±0.11,P<0.05 vs组①、②),同时注射HOCl-alb使糖尿病大鼠尿蛋白排泄量增加(③0.34±0.09 vs④0.51±0.10,P<0.01),SS-31干预治疗则可显著减轻HOCl-RSA引起的尿蛋白排泄量增加(④0.51±0.10 vs⑤0.27±0.08,⑥0.30±0.11,P<0.01)。4、肌酐清除率：糖尿病组大鼠肌酐清除率均高于正常组对照组①、②(①6.24±1.09,②6.37±1.22 vs③10.61±2.36,④13.95±4.62,⑤7.67±1.84,⑥8.80±2.03,P均<0.05),注射HOCl-alb使糖尿病大鼠肌酐清除率升高(③10.61±2.36 vs④13.95±4.62,P<0.05),SS-31干预治疗则可改善HOCl-alb引起的肌酐清除率升高(④13.95±4.62 vs⑤7.67±1.84,⑥8.80±2.03,P<0.01)。二、肾组织病理学改变肾组织经Masson染色和PAS染色,光镜下观察显示,正常对照组大鼠肾小球结构完整,大小均一,基底膜、系膜无增生,肾小管管壁光滑无变性。糖尿病组大鼠肾小球体积增大,肾小球基底膜增厚和系膜轻度增生,肾小管上皮细胞呈灶性脱落坏死、颗粒样和空泡样变性。注射HOC1-RSA组糖尿病大鼠比注射RSA组糖尿病大鼠病理改变更明显,部分肾小球已阶段性硬化,而注射SS-31组糖尿病大鼠的大部分病理改变则被阻断。三、氧化应激指标变化：1、血浆HOCl-alb含量糖尿病组大鼠血浆HOCl-alb高于正常对照组①、②(①85.34±11.28,②100.63±14.7 vs③193.54±10.69,④426.67±14.94,⑤143.33±4.39,⑥237.5±12.16,P均<0.05),注射HOC1-RSA可升高糖尿病大鼠血浆HOCl-alb水平(③193.54±10.69 vs④426.67±14.94,P<0.01),SS-31干预则可减轻HOCl-RSA引起的血浆HOCl-alb水平的升高(④426.67±14.94 vs⑤143.33±4.39,⑥237.5±12.16,P<0.01)。2、肾组织匀浆HOCl-alb含量糖尿病组大鼠肾匀浆HOCl-alb含量高于正常对照组①、②(①5.67±0.19,②6.75±0.37 vs③16.32±1.07,④20.25±1.02,⑤9.38±0.75,⑥15.71-0.38,P均<0.05),注射HOCl-RSA可升高糖尿病组大鼠肾匀浆HOCl-alb水平(③16.32±1.07 vs④20.25-1.02,P<0.01),SS-31干预治疗则可减轻HOCl-RSA引起的肾匀浆HOCl-alb水平升高(④20.25±1.02 vs⑤9.38±0.75,⑥15.71±0.38,P<0.01)。3、尿8-OHdG定量糖尿病组大鼠24小时尿8-OHdG定量高于正常对照组①、②(①52.88±13.45,②58.56±20.65 vs③170.83±23.29,④473.2±66.69,⑤93.77±48.9,⑥132.86±54.18,P均<0.05),注射HOCl-RSA使糖尿病大鼠尿8-OHdG增加(③170.83±23.29 vs④473.2±66.69,P<0.01),SS-31干预治疗则可减轻HOCl-RSA引起的尿8-OHdG水平升高(④473.2±66.69 vs⑤93.77±48.9,⑥132.86±54.18,P<0.01)。四、Cyt C蛋白表达的变化：应用Western Blotting检测了细胞色素C的表达。结果显示,与正常对照大鼠相比,糖尿病大鼠胞浆内Cyt C蛋白水平明显增加(P<0.015 vs组①、②)；与注射RSA组糖尿病大鼠相比,注射HOCl-RSA组糖尿病大鼠胞浆内Cyt C水平进一步增加(P<0.008 vs组③)；SS-31干预则可改善HOCl-RSA引起的胞浆内Cyt C水平增加(P<0.021 vs组④)各组线粒体内Cyt C蛋白水平的变化与胞浆内Cyt C蛋白水平的变化相反。五、足细胞凋亡的变化采用TUNEL荧光标记法检测凋亡的足细胞。与正常对照组相比,糖尿病大鼠TUNEL阳性细胞数目明显减少(P<0.028 vs组①、②)；注射HOCl-RSA组糖尿病大鼠TUNEL阳性的足细胞比注射RSA组糖尿病大鼠显著增高(p=0.012)；线粒体靶向肽SS-31干预显著降低了HOCl-RSA诱导的足细胞凋亡(p=0.023)。提示了SS-31能降低足细胞氧化应激,进而减少了足细胞凋亡。六、凋亡相关蛋白表达：在氧化应激诱导凋亡的信号通路中,caspase-3是caspase级联反应下游最关键的凋亡执行者。应用Western Blotting检测caspase-3, caspase-7, caspase-9, PARP-1蛋白的表达。结果显示,与正常对照大鼠相比,糖尿病大鼠caspase-3. caspase-7, caspase-9, PARP-1均伴随裂解片段的显著增加(P<0.023 vs组①、②)；与注射RSA组糖尿病大鼠相比,注射HOCl-RSA组糖尿病大鼠caspase 3, caspase 7, caspase 9, PARP-1裂解片段进一步增加(P<0.005 vs组③)：而注射SS-31组糖尿病大鼠裂解片段的表达则大幅减少(P<0.019 vs组④)。七、足细胞丢失数量的变化：为了验证HOCl-alb诱导足细胞凋亡导致肾小球足细胞丢失,足细胞数目减少,应用足细胞细胞核特异性抗原WT-l染色肾小球足细胞来计数肾小球足细胞数目。每个肾小球记录WT-1阳性核染色数目。每组选取8只大鼠,随机选择50个肾小球计算WT-1阳性核数目,取平均值。结果显示,与正常对照组相比,糖尿病大鼠WT-1阳性细胞数目明显减少(P<0.030 vs组①、②)；与注射RSA组糖尿病大鼠相比,注射HOCl-RSA组糖尿病大鼠WT-1阳性细胞数目进一步降低(P<0.011 vs组③)；SS-31干预显著改善了HOCl-RSA诱导的足细胞丢失(P<0.009 vs组④)。采用Western Blotting检测WT-1蛋白的表达。结果显示,与正常对照组相比,糖尿病大鼠WT-1蛋白水平明显减少(P<0.018 vs组①、②)：注射HOCl-RSA组糖尿病大鼠比注射RSA组糖尿病大鼠WT-1蛋白水平进一步降低(P<0.003 vs组③)；SS-31干预显著改善了HOCl-RSA诱导的WT-1蛋白水平降低(P<0.007vs组④)。结论一、HOCl-alb加重糖尿病大鼠蛋白尿、肾小球高滤过和肾损伤,其机制可能是通过诱导体内氧化应激和线粒体损伤,细胞色素C外流,胞浆中细胞色素C水平上调激活凋亡相关信号,进而导致足细胞凋亡、足细胞丢失和数量减少。二、线粒体靶向肽的干预阻止了HOCl-alb诱导的足细胞凋亡,从而起到肾保护作用。因此,阻断线粒体氧化应激损伤,可能成为能够延缓糖尿病肾病进展、改善糖尿病肾病预后的新靶标。