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背景支气管哮喘的主要病理改变是气道黏膜水肿、不同程度的嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润,其发生机制十分复杂,涉及遗传、环境和免疫调节等多个方面,其中免疫异常或免疫平衡失调在疾病的发生发展中发挥着重要的作用。Th2细胞的优势状态、气道高反应性和组织重塑构成哮喘的特征性三大病理改变。哮喘时呈现的Th2细胞极化状态与多种因素相关,然而这种气道的炎症损伤与Th1/Th2细胞失衡的因果关系及其可能的机制尚不十分清楚,深入探讨诱导Th2细胞极化与维持Th2细胞优势状态的细胞和分子基础,有助于进一步认识和理解哮喘的免疫病理机制,为纠正疾病发生时的免疫失衡和精准诊治提供依据。目的气道上皮细胞是机体感受外源性刺激的初始部位,其发生的结构和功能的改变,与支气管哮喘的发生和Th2细胞介导的炎症有着密切的关系。本研究旨在从源头上分析导致哮喘机体Th2细胞极化的始动因素,探讨免疫平衡失调状态下形成的IL-9优势及其对Th2应答相关免疫细胞的影响。方法1、实验动物的来源及饲养:BALB/c小鼠,雌性,6-8周龄,体重18-20g,购自扬州大学比较医学中心。随机分为2组（哮喘模型组和对照组）,每组5～8只,饲养于江苏大学实验动物中心。2、构建OVA诱导的哮喘小鼠模型,观察建模小鼠哮喘发作:如呼吸加快甚至点头呼吸、竖毛、口唇发紫、前肢缩抬、反应迟钝等症状表现;通过HE染色进行肺部炎症的病理分析;收集肺泡灌洗液（BALF）作细胞计数;检测外周血嗜酸性粒细胞;免疫组化和ELISA法检测肺部或血清Ig E的水平。3、qRT-PCR或ELISA分析哮喘小鼠模型外周血或肺组织Rac1、IL-33的表达水平;外源性Rac1或Rac1-si RNA转染呼吸道上皮细胞和巨噬细胞,体外分析Rac1对呼吸道上皮细胞凋亡和吞噬细胞功能的影响,探讨其与气道高压的形成、触发II型免疫应答和哮喘发生的关系。4、应用流式细胞分析技术、免疫组化染色、ELISA和qRT-PCR等方法,分析哮喘小鼠模型肺组织、脾脏和外周血中IL-9、IL-5、IL-13、IL-33等细胞因子以及RORa、T-bet、GATA3等转录因子的表达水平;观察ILC2s、Th2、Th9等细胞比率;分析有关细胞因子和转录因子的表达水平与Th2应答的相关性,以了解维持哮喘机体Th2细胞优势分化状态的因素。5、流式细胞分析、免疫组化和qRT-PCR法检测哮喘小鼠模型肺组织和肺泡灌洗液中的IL-9和Th9细胞;以探讨IL-9和Th9细胞在哮喘发生过程中的可能机制。6、体外细胞培养技术和Western blot等技术分析IL-9对BMDMs分化的影响;应用流式细胞分析、免疫组化和qRT-PCR法观察体外培养条件下IL-9对初始T细胞分化为Th2细胞的影响。结果1、Rac1的表达及其对气道上皮细胞凋亡和凋亡细胞清除的影响（1）动物试验结果表明,经鉴定诱导成功的哮喘模型小鼠比对照小鼠的Rac1表达水平明显降低（P<0.005）,而IL-33的表达则明显升高（外周血中P<0.005;肺组织中P<0.001）。（2）应用气道上皮细胞系的体外研究发现,Rac1 si RNA转染或Rac1抑制剂NSC23766/EHT1864处理气道上皮细胞,可促进姜黄素诱导的细胞凋亡和减弱吞噬细胞的吞噬能力（与未处理组相比,P<0.005）。（3）与对照组相比,转入外源性Rac1基因的气道上皮细胞迁徙能力明显增强（P<0.001）,而Rac1-si RNA转染和NSC23766处理的气道上皮细胞迁徙能力则明显降低（P<0.005）。此外,Rac1抑制剂可上调RAW264.7细胞CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达水平（与对照组相比,均有显著差异,P<0.001）。2、Th2细胞是Th0向Th9细胞分化的中间产物体外研究结果表明,初始T细胞（Th0）向Th9细胞分化的最佳条件为:5ng/ml TGF-β和30 ng/ml IL-4作用5天,在此条件下Th0细胞可首先分化为Th2细胞（3天左右）,继而分化为Th9细胞（第5天）。qRT-PCR的结果还显示,在TGF-β和IL-4诱导的Th9细胞分化过程中,Smad3、Smad4和IRF4的表达均明显升高（与对照组相比P<0.05）。3、哮喘模型小鼠肺组织Th9、ILC2s及其相关细胞因子受体的表达（1）与对照组小鼠相比,哮喘模型鼠肺组织中IL-9产生细胞（Th9）和ILC2s均明显增多（P<0.05;P<0.01）;且肺组织中RORa、PU.1、IL-5R、IL-9R、IL-13R和FcεR等受体的表达水平也显著高于对照小鼠（均为P<0.0001）。（2）哮喘小鼠模型肺组织中ILC2s相关受体与Th9相关细胞因子（IL-9）的表达呈正相关（RORa与IL-9:r=0.6883,P=0.0278;IL-5R与IL-9:r=0.7646,P=0.0100;IL-13R与IL-9:r=0.8112,P=0.0044）。（3）哮喘小鼠模型炎性肺组织IL-5Rα、IL-13R、IL-9R表达水平与血清Ig E水平呈显著正相关（r=0.8522,P=0.0017;r=0.8211,P=0.0036;r=0.8926,P=0.0005）。4、IL-9对巨噬细胞分化的影响结果显示,骨髓细胞表达高水平的IL-9R,而BMDMs的IL-9R表达水平极低（几乎不表达）,两者比较差异显著（P<0.005）。IL-9的刺激对BMDMs的分化和活性并无直接影响,既不能直接刺激M2巨噬细胞的分化,也不能直接影响M1细胞活性。结论Rac1表达下调与气道高压相关,并促进IL-33表达以构成ILC2s极化的基础;ILC2s、Th9细胞及其产生的IL-13、IL-4和IL-9等共同发挥着维持Th2细胞的优势分化状态,参与哮喘的免疫病理机制。