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随着现代医学的发展，人们对肿瘤的了解也越来越多，认识到肿瘤是机体在各种环境和遗传的致癌因素以协同或序贯的方式引起DNA损害，激活原癌基因和突变肿瘤抑制基因，以及凋亡调节基因的改变等，引起表达水平的异常，使得靶细胞转化并克隆性异常增生，最终形成恶性肿瘤。局部浸润和远处转移是恶性肿瘤最重要的特点，也是恶性肿瘤致死率高的主要原因，然而目前还未找到针对肿瘤这两个特点的治疗方法。非编码序列约占人类基因组99%，microRNA的发现正是源于科学家在肿瘤治疗过程中对非编码序列的研究，它结合靶基因mRNA的3’UTR来调控基因的表达，在肿瘤的发生发展中起着重要作用。通过高通量芯片miRNA筛选发现，miR-133a、miR-143、miR-422a等在骨肉瘤中显著下调。其中，人们对miR-133a和miR-143已进行了一定的研究，但对miR-422a的了解较少，它在骨肉瘤中的作用机制目前仍然未知。因此，本课题中我们对miR-422a的生物学功能及其作用机制进行了研究，发现miR-422a在骨肉瘤细胞系和骨肉瘤临床样本中显著下调。功能学研究显示，miR-422a具有抑制抗凋亡作用以及阻遏细胞在G1/G0期、从而抑制肿瘤的生长的功能。通过更进一步的探究，以生物信息学预测和实验来证实应用于miR-422a的靶基因，结果显示miR-422a抑制肿瘤生长的作用是通过靶向和抑制Bcl2l2与Kras的表达来实现。总之，我们的数据说明了miR-422a在骨肉瘤中的发病机制，提示了它在癌症治疗中潜在的作用。第一部分：miR-422a由于组蛋白H3K9me3、H3K27me3的甲基化与H3K4me3的去甲基化引起在骨肉瘤中下调表达。首先我们通过qRT-PCR实验证实了miR-422a在骨肉瘤细胞系和骨肉瘤临床样本中下调表达，并研究了miR-422a发生下调的机制。实验发现miR-422a在骨肉瘤细胞系MG63和U2OS中出现下调表达；分析临床骨肉瘤患者的样本miR-422a的表达发现：在骨肉瘤患者临床样本中，miR-422a也发生了表达下调。研究miR-422a表达改变的分子机制，通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）结合qRT-PCR，发现相关细胞系中miR-422a上游启动子区域抑制性组蛋白修饰H3K9me3、H3K27me3和H4K20me1以及活化性组蛋白修饰H3K4me3、H3K36me3和H3K79me2的甲基化情况。结果显示骨肉瘤细胞系中抑制性组蛋白修饰H3K9me3与H3K27me3相对于成骨细胞系发生了显著上调，活化性组蛋白修饰H3K4me3发生显著下调。我们又结合骨肉瘤组织临床样本进行验证，得到的结果与在骨肉瘤细胞系中的结果一致。第二部分：miR-422a通过抑制抗凋亡作用以及阻遏细胞在G1/G0期，从而抑制肿瘤的生长为了探讨骨肉瘤中miR-422a下调的生理作用，我们分析了miR-422a使用其拟似物（mimics）或抑制物（inhibitor）使骨肉瘤细胞内高表达或低表达miRNA后对细胞增殖的作用。实验数据提示高表达miR-422a可明显抑制细胞的增殖，并且在细胞系中转染miR-422a的抑制物使miR-422a低表达时，细胞增殖被促进，从而证明了miR-422a是一重要的肿瘤抑制因子。此外，我们还通过裸鼠体内皮下注射成瘤性试验证实了miR-422a可以在体内试验中抑制骨肉瘤增殖。之后，我们研究了miR-422a低表达时可以促进骨肉瘤细胞生长的分子机制，即miR-422a可能是通过促进肿瘤细胞凋亡或抑制细胞增殖两种途径产生的。我们通过Annexin V/PI双染检测了转染miR-422a拟似物及其对照RNA后的骨肉瘤细胞凋亡情况与各细胞周期细胞。结果显示，miR-422a本身不会诱导骨肉瘤细胞的凋亡，但是其表达上调可以抑制抗凋亡相关基因的表达，促进骨肉瘤细胞在恶劣环境中的凋亡比例的提高；另一方面，miR-422a高表达后可以将骨肉瘤细胞阻遏在G0/G1期，从而抑制其增殖。第三部分：miR-422a靶向Bcl2l2与Kras发挥抑制骨肉瘤生长的作用这一部分我们探讨了miR-422a作用于哪个靶分子可以发挥抑制骨肉瘤生长的作用。通过miRecords（http://mirecords.biolead.org/）在线软件，我们发现miR-422a在Bcl2l2的3’UTR区域的3-9与1557-1564位点、Kras的3’UTR区域的286-309位点以及Nras的3’UTR区域的1904-1926位点存在保守的靶位点。于是我们使用双荧光报告试剂盒检测荧光素酶的活性，结果发现miR-422a可以作用于Bcl2l23’UTR（1557-1564位点）和Kras3’UTR（286-309位点）发挥负调控作用。而Bcl2l23’UTR的3-9位点和Nras3’UTR的1904-1926位点均呈假阳性，不是miR-422a的潜在作用位点。此外结合检测转染miR-422a拟似物后细胞中的Bcl2l2和Kras的mRNA表达量与蛋白表达量的变化，初步证实了miR-422a靶向Bcl2l2和Kras，抑制肿瘤生长。为了更进一步验证，我们合成了Bcl2l2和Kras两个基因的干扰RNA，进行rescue实验对靶基因验证。结果证明了miR-422a在骨肉瘤中发生下调表达，通过靶向Bcl2l2与Kras，抑制了骨肉瘤的生长。