神经母细胞瘤的发病多是由于基因缺陷引起，包括MYCN基因的扩增，1号染色体短臂的缺失，11号染色体长臂的缺失和17号染色体长臂的增添(gain)。其中，以17号染色体长臂的增添在高风险神经母细胞瘤中最为常见，然而有关候选基因的作用机理至今仍不清楚。 在本研究中，我们利用细菌人工染色体(BAC)基因芯片对236例神经母细胞瘤样本进行了比较基因组杂交(array—Comparative Genomic Hybridization，array—CGH)分析，利用涵盖5340个cDNA的基因芯片对136例神经母细胞瘤样本进行基因表达谱分析。综合上述数据，结果发现位于人17号染色体2区5段1带(17q25.1)存在一个新基因。该基因从未被报道过，通过鉴定发现该基因有2个剪切体，即Nbla10727和Nbla12061。Northern Blot结果提示该基因mRNA转录长度大约为2.3kb，生物信息学分析结果显示该基因不含有长的开放阅读框架(Open Reading Frame，ORF)，而[35S]—标记的体内、体外翻译实验结果显示该基因不能产生任何的蛋白质产物。这些结果提示了该基因为非编码RNA，由于临床数据显示该基因在恶性度高、预后差的神经母细胞瘤里异常高表达，因此取名为ncRAN(non—coding RNA expressed in Aggressive Neuroblastoma)。 对70例散发神经母细胞瘤病例进行基因表达谱分析显示，该基因的mRNA高表达与患者的不良预后存在明显的相关性(p<0.001)。多因素分析结果显示ncRAN的mRNA表达是不依赖于发病年龄、肿瘤的分期、肿瘤原发灶以及MYCN基因的扩增，而存在的独立预后因素。软琼脂克隆形成实验证明外源性表达ncRAN能够诱导小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)产生细胞集落。沉默ncRAN基因后，神经母细胞瘤细胞系SH—SY5Y生长明显受到抑制。由此鉴定，ncRAN基因是定位于人17号染色体上的长的非编码RNA，并在神经母细胞瘤中具有癌基因的特性。 实验方法： 一、临床资料 收集的神经母细胞肿瘤样本来自日本多个医疗机构，经手术或是送检而得。236例神经母细胞瘤样本用于比较基因组杂交技术分析，136例样本用于基因表达谱的分析，其中各有112例和70例散发病例。临床标本根据国际神经母细胞瘤分期系统(INSS)进行分类。70例散发病例中临床Ⅰ期15例，Ⅱ期8例，Ⅲ期17例，Ⅳ期25例，Ⅳs期5例，该样本的表达分析用于Kaplan—Meier生存曲线分析。本病例中相对应的MYCN扩增情况已在发表文章中报道。 二、方法 1、比较基因组杂交技术(array—CGH)和表达谱基因芯片技术利用包涵整个人类基因组的2464个细菌人工染色体(BAC)克隆的生物芯片，对236例神经母细胞瘤进行比较基因组杂交技术分析，分辨率小于1.2Mb。从临床分期不同的神经母细胞瘤组织提取RNA，通过oligo—capping法建立cDNA文库获得5340个cDNA，对136例神经母细胞瘤进行基因表达谱分析，该芯片仅限于日本千叶癌中心研究局的相关神经母细胞瘤研究。比较基因组杂交(array—CGH)和表达谱基因芯片的相关数据可以登录美国国家生物技术信息中心(NCBI)高通量基因表达数据库(http：//www．Ncbi．Nlm．Nih．Gov/geo/)进行查询。相应数据库编号分别为GSE5784和GSE5779。 2、细胞培养和转染 用含10％灭活胎牛血清及抗生素的DMEM培养基或是RPMI1640培养基对NIH3T3和COS7以及入神经母细胞瘤细胞系进行培养。培养环境为37℃，CO2分压为5％的细胞培养箱。根据厂家说明，用Lipofectamine2000(Invitrogen)进行COS7和NIH3T3细胞的瞬时转染。 3、质粒构建 在原发神经母细胞瘤cDNA文库中，克隆出Nbla10727和Nbla12061的cDNA全长，并将其插入到真核表达载体pcDNA3或是pcDNA3—FLAG质粒中。 4、体外转录和翻译 利用TNT T7 Quick coupled transcription/translation system(Promega)，根据产品说明用[35S]—标记甲硫氨酸对蛋白产物进行标记。之后，对相应的蛋白产物进行SDS-PAGE凝胶电泳和放射自显影检测。 5、[35S]—蛋白标记 将含有FLAG—ncRAN和HA—MEL1的表达载体瞬时转入COS7细胞系。24小时后，1×PBS润洗细胞三次后，加入不含甲硫氨酸和抗生素的新鲜培养基。2小时后，加入浓度为0.1mCi/ml[35S]—标记甲硫氨酸的培养基，继续培养。收集细胞后，全细胞裂解液用于免疫共沉淀，进行SDS-PAGE凝胶电泳和放射自显影检测。 6、RNA分离及半定量PCR 利用AGPC法将total RNA从冷冻组织中分离出来。按照试剂盒说明，利用逆转录系统，在系统中加入随机引物和SuperScriptⅡ逆转录酶，将5μg total RNA用于合成DNA的第一条链。以甘油醛—3—磷酸脱氢酶(GAPDH)作为定量对照，将各个样品进行稀释至同一浓度。聚合酶链反应(PCR)为28个循环，95℃预热2min，95℃变性15sec，55℃退火15sec，72℃延伸20sec。 7、Northern Blot实验 收集神经母细胞瘤细胞total RNA20μg进行变性电泳，转膜之后，进行紫外交联固定，将标记有[α—32P]—dCTP的探针，与硝酸纤维素膜进行杂交用于检测。 8、软琼脂克隆形成实验 将FLAG—ncRAN及相应的空载体质粒瞬时转染至小鼠成纤维细胞NIH3T3中，将转染后的细胞重悬至含10％胎牛血清、0.33％(wt/vol)低沸点琼脂的DMEM培养基，密度为500个细胞/培养皿(D=35mm)，均匀种进已铺好含0，5％(wt/vol)琼脂DMEM培养基里。在37℃CO2分压为5％的细胞培养箱内培养，14天后在显微镜下，计数阳性克隆数(阳性克隆直径>100μm)。 9、RNA干扰实验 将带有SacⅠ和XhoⅠ酶切位点且能干扰ncRAN基因表达的寡核苷酸连接至pMuni空载体上。寡核苷酸序列为5—CCCCATCCTCTAGTAGCCACGGTTTCAAGAGAACCGTGGCTACTAGAGGATTTTTTGGAAAC—3 and5-TCGAGTTTCCAAAAAATCCTCTAGTAGCCACGGTTCTCTTGAAACCGTGGCTACTAGAGGATGGGGAGCT—3’。利用Lipofectamine2000(Invitrogen)将含有寡核苷酸的质粒瞬时转入SH—SY5Y细胞系中。 三、统计方法 t—检验用于分析ncRAN的表达与其他因素的可能相关性，例如发病年龄等等。见累积后的生存病例进行Kaplan—Meier曲线和log—rank检验分析。单因素和多因素分析采用Cox风险比例模型。因为ncRAN基因的表达情况来自5340个基因样本的芯片，所以考虑q值。在数据统计中，p<0.05被认为有统计学意义。 结论： 1、ncRAN基因经鉴定后，确定其为首次报道的一个新基因，定位于人17q25.1，并与神经母细胞瘤的发病相关。 2、ncRAN基因的高表达与神经母细胞瘤患者的预后有着密切的关联。 3、ncRAN具有原癌基因的特性的长的非编码RNA。