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第一部分EIF4E在白血病和淋巴瘤细胞系中的表达目的探讨真核细胞翻译起始因子4E(EIF4E)在人白血病和淋巴瘤细胞系中的表达。方法采用RT-PCR和western-blot方法研究了6株人白血病、淋巴瘤细胞系(人急性单核细胞白血病细胞系U937,人急性早幼粒细胞白血病系HL60,人慢性粒细胞白血病细胞系K562,人急性淋巴细胞白血病细胞系Molt-4,人Burkit淋巴瘤细胞系Raji和Daudi)和正常人外周血单个核细胞EIF4E的表达。结果EIF4E在人白血病、淋巴瘤细胞系和正常人外周血单个核细胞中均有表达,正常人外周血单个核细胞EIF4E低度表达,而6株人白血病细胞系都在mRNA水平高表达EIF4E, K562、Molt-4、HL60、Raii、Daudi和U937细胞中,EIF4E表达的平均相对吸光度值分别为HL-60:(1.12±0.03)、Molt-4: (3.20±0.08)、K562: (4.11±0.03)、Raji: (4.92±0.03)、Daudi: (3.73±0.02)、U937:(2.06±0.03),而正常人EIF4E表达的平均相对吸光度值为0.30±0.02;同时,EIF4E蛋白在各株细胞系中均有强度不等的表达,在6个细胞系中,EIF4E表达的平均相对吸光度值分别为HL-60:(0.72±0.11)、Molt-4:(1.30±0.08)、K562:(1.86±0.03)、Raji: (3.42±0.23)、Daudi: (3.02±0.17)、U937: (1.39±0.03),而正常人EIF4E表达的平均相对吸光度值为0.39±0.06。可见RT-PCR检测mRNA表达高的细胞系,其蛋白表达水平也同样高,EIF4E蛋白水平的实验结果与RT-PCR结果一致。结论EIF4E可能在白血病和淋巴瘤的发生发展中起一定作用。第二部分正、反义EIF4E真核表达载体的构建及鉴定目的构建正、反义人全长EIF4E基因真核表达质粒,为研究EIF4E基因功能提供工具。方法根据EIF4E基因cDNA序列中编码序列,设计PCR引物,在上下游引物5’端分别添加ApaⅠ和KpnⅠ酶切位点,RT-PCR从K562细胞中获得760bp的DNA片断,然后将该片断正、反向插入真核表达载体pEGFP-C1的多克隆位点,构建正、反义EIF4E基因片断真核表达质粒,并用PCR、酶切法和DNA测序鉴定。结果PCR鉴定得到512bp特异条带,双酶切鉴定得到760bp片断和4.7kb载体片断,DNA测序说明插入片断序列是正确的。DNA测序说明插入片段序列与人EIF4E基因的cDNA序列完全相同,说明克隆至pEGFP-C1多克隆位点上的DNA片段序列是正确的。结论通过基因克隆技术,成功构建了正、反义EIF4E基因真核表达质粒,为进一步研究EIF4E基因功能提供了实验工具。第三部分EIF4E对慢性粒细胞白血病细胞增殖的影响目的翻译控制在肿瘤细胞早期发展、分化和细胞周期过程中起着重要的作用。翻译起始因子是真核细胞翻译过程的限速因子,在CML患者白血病细胞和CML细胞系K562中高表达。本文旨在研究EIF4E对CML细胞增殖的影响。方法正、反义重组EIF4E质粒电转染至K562细胞中,采用G418稳定筛选转染正义EIF4E质粒(pEIF4E)的稳定细胞系,流式细胞仪分选瞬时转染反义EIF4E质粒(pEIF4Eas)的细胞。通过流式细胞术和荧光显微镜观察确定细胞转染效率,RT-PCR,western-blot和免疫细胞化学检测EIF4E蛋白和mRNA水平的改变。体外观察EIF4E表达改变对K562细胞周期、增殖和cyclinDl表达的影响。结果成功获得转染重组正义EIF4E质粒后的阳性细胞克隆(pEIF4E/K562),相对于转染空质粒和未转染的K562细胞,pEIF4E/K562细胞EIF4E的mRNA和蛋白表达明显增高且细胞生长加速。相反,通过流式细胞术分选pEIF4Eas/K562细胞,免疫细胞化学和激光共聚焦检测其EIF4E蛋白表达下调,同时出现了明显的G1期阻滞和G1期正调控基因cyclin D1表达下调。结论EIF4E基因在慢性粒细胞白血病细胞系K562的细胞增殖中起重要作用,其表达增高促进K562细胞的增殖。第四部分EIF4E对慢性粒细胞白血病细胞分化的影响目的研究表明,EIF4E不仅和肿瘤细胞的恶性增殖密切有关,还与某些肿瘤细胞的分化密切相关,多数情况下,EIF4E表达上调可阻滞肿瘤细胞的诱导分化。失分化和恶性增殖是白血病细胞的特征,为此,我们研究了EIF4E在诱导慢性粒细胞白血病细胞分化中的作用。方法以pEIF4E/K562、pEGFP-C1/K562和K562细胞为研究对象,分别以Hu、TPA和HMBA为诱导剂诱导向红细胞系、巨核细胞系及单核巨噬系分化。采用瑞氏-姬姆萨染色观察细胞诱导前后形态改变,并采用联苯胺染色、CD41和CD14的表达率分别检测诱导后红系祖细胞、巨核细胞和单核细胞的表达率。结果pEGFP-C1/K562和K562细胞在诱导后分别向红细胞祖细胞、巨核细胞及单核细胞的形态转变,而pEIF4E/K562在诱导前后形态转变不明显。pEGFP-C1/K562和K562细胞经Hu诱导后OD值明显上升,pEIF4E/K562细胞经Hu诱导后OD值无明显上升;pEGFP-C1/K562和K562细胞经TPA和HMBA诱导后,其CD41和CDl4的表达率上升,而pEIF4E/K562细胞的表达率无明显上升。结论EIF4E的表达上调可阻滞K562细胞的分化,可能在慢性粒细胞白血病失分化的发病机制中起到了重要的作用。