原发性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）属于常见的恶性肿瘤之一，它在全球范围内影响着人类的健康，缩短了患者的生存时间，降低了其生活质量。其发病率在恶性肿瘤中位居世界第五，死亡率位居世界第三，每年有一百万的新增病例。HCC具有侵袭性强、瘤体增长迅速、对化疗抵抗、术后复发率高等特点。近年来，尽管有新的化疗药物和治疗策略的广泛应用，但是，对于HCC的治疗仍不理想。因此，如何增加患者的生存期，提高患者的生存质量，以及如何更加有效的治疗HCC，已经变得十分迫切与必要。三氧化二砷（Arsenic trioxide，As203）是中国传统中药——砒霜的有效成分。早在上世纪70年代，As2O3就已经作为治疗急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocyticleukemia，APL）的临床药物。近年来，大量研究证实As2O3对实体瘤细胞在体内和体外都有作用，尤其是在肝癌细胞中，进一步被证实有抑制肝癌细胞增殖的作用。相关的机制研究表明，肝癌细胞的凋亡与线粒体通路有关。经研究表明，As2O3诱导肝癌细胞凋亡时，会有大量的活性氧产生（reactive oxygen species，ROS），然而，当加入抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸N-acetyl-L-cysteine，NAC后，可以抑制As203诱导肝癌细胞凋亡。As2O3诱导肝癌细胞凋亡的机制是通过激活线粒体通路，且可以抑制Bcl-2蛋白的表达，增加Bax蛋白的表达，同时释放细胞色素C（cytochrome c，cyt c）进入到了细胞质内，从而激活半胱氨酸天冬氨酸特异性酶（Cysteine aspartic acidspecific protease，caspase），进而可以进行级联反应，最终引起细胞的凋亡。Smac与cyt c一样，同为线粒体蛋白，其引起细胞凋亡的机制为通过抑制凋亡抑制蛋白（Inhibitors of apoptosis protein，IAP），消除其对caspase的抑制作用，从而使caspase进入到细胞质中，发挥作用，最终导致细胞的凋亡。为了进一步探讨As2O3诱导肝癌细胞凋亡的线粒体通路，以及相关蛋白的表达情况，我们选取两个常用的HCC细胞系，分别进一步探讨As2O3是否通过调节ROS介导的线粒体通路发挥诱导肝癌细胞凋亡的作用，以及As2O3是否通过调节线粒体相关蛋白的表达从而发挥诱导肝癌细胞凋亡的作用。【目的】1.培养肝癌细胞系，分别为SMMC-7721细胞系及HepG2细胞系。2.探讨As2O3是否可以将肝癌细胞的增殖所抑制并且诱导肝癌细胞的凋亡。3.探讨As2O3是否通过ROS介导的线粒体通路发挥诱导肝癌细胞凋亡的作用。4.探讨As2O3是否通过调节相关线粒体蛋白的表达从而发挥诱导肝癌细胞凋亡的作用。【方法】1.细胞培养及分组：(1) SMMC-7721肝癌细胞系，人肝癌细胞系置于含有10%胎牛血清的1640培养基，并放入培养箱培养，24h后换液，48h后用胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的细胞，将其随机分为4组，分别加入含有0、5、10、20μM As2O3的培养液，被随机分为了4组。(2) HepG2肝癌细胞系，将人肝癌细胞系HepG2置于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，并放入培养箱内进行培养，24h后换液，48h后用胰蛋白酶消化且将其传代。取对数生长期的细胞，随机分为5组，分别加入0、2、5、15μMAs2O3的新鲜培养液，第5组加入15μMAs2O3的新鲜培养液前需要用10mM的NAC预处理1h。从而将HepG2肝癌细胞系随机分为5组。2.噻唑蓝还原法（MTT法）观察As2O3对肝癌细胞活性的影响。3. Hoechst33258染色观察凋亡细胞核形态学变化。4.流式细胞仪检测细胞凋亡。5. DCFH-DA活性氧检测试剂盒测量细胞内ROS的量。6. Rhodamine123检测线粒体膜电位的变化。7.蛋白免疫印记（Western Blot）法检测细胞凋亡蛋白水平的表达。【结果】1.MTT法显示：(1)肝癌细胞的活力随着As2O3浓度的增加及用药时间的延长，而呈现的是递减的趋势。浓度为5μmol/L的AS2O3作用于肝癌细胞48h后，细胞活力有所下降（94.23±1.52%，P<0.05）；浓度为10μmol/L的AS2O3作用于肝癌细胞后72h后，细胞活力明显下降（78.21±1.73%，P<0.01）；而当浓度为20μmol/L的AS2O3作用于肝癌细胞后72h后，细胞活力仍明显下降（49.65±0.83%，P<0.01）。(2)肝癌细胞的活力是随着As2O3浓度的增加及用药时间的延长，而呈现的是递减的趋势。浓度为5μmol/L的AS2O3作用于肝癌细胞48h后，细胞活力有所下降（78.12±1.51%，P<0.01）；浓度为15μmol/L的AS2O3作用于HepG2细胞后72h后，细胞活力明显下降（59.13±1.72%，P<0.01）。然而，当给予抗氧化剂NAC阻断之后，细胞活力下降的趋势则被抑制，与高剂量组比较，作用于72h后，细胞活力上升至（84.23±2.12%，P<0.01）。2.Hoechst3325染色观察凋亡细胞核形态学变化显示：(1)在原发性肝癌SMMC-7721细胞中，随着As2O3浓度的增加，各组出现的凋亡征象也就越发地明显。在给予5、10、20μmol/L的As2O3处理SMMC-7721细胞后，核固缩，染色质凝聚的细胞数分别增加到（11.23±1.52%，P<0.01），（23.22±2.29%，P<0.01），（42.45±3.17%，P<0.01）。(2)在原发性肝癌HepG2细胞中，随着As2O3浓度的增加，各组出现的凋亡征象也就越发地明显。在给予2、5、15μmol/L的As2O3处理HepG2细胞后，核固缩，染色质凝聚的细胞数分别增加到（17.73±0.91%，P<0.01），（24.23±2.21%，P<0.01），（47.54±2.92%，P<0.01）。然而，当给予抗氧化剂NAC阻断之后，凋亡的细胞则会减少，与高剂量组比较，核固缩，染色质凝聚的细胞数减少到（19.77±2.12%，P<0.01）。3.流式细胞仪检测细胞凋亡显示：(1)在原发性肝癌SMMC-7721细胞中，随着As2O3剂量的增加，各组细胞凋亡率和坏死率呈逐渐增加的趋势，同时，活细胞率则会越来越少。在给予5、10、20μmol/L的As2O3处理肝癌细胞后，细胞的凋亡比例从1.94±0.58%（未用As2O3处理的细胞）增加至（23.67±2.19%，P<0.01），（39.22±1.95%，P<0.01），（54.23±2.46%，P<0.01）。(2)在原发性肝癌HepG2细胞中，随着As2O3剂量的增加，各组细胞凋亡率和坏死率呈逐渐增加的趋势，同时，活细胞率则会越来越少，呈剂量依赖性。在给予2、5、15μmol/L的As2O3处理HepG2细胞后，细胞的凋亡比例从2.82±0.55%（未用As2O3处理的细胞）增加至（18.91±2.77%，P<0.01），（38.75±1.92%，P<0.01），（59.18±1.79%，P<0.01）。然而，当给予抗氧化剂NAC阻断之后，凋亡的细胞则会减少，与高剂量组比较，细胞凋亡的数目减少到（13.1±2.13%，P<0.01）。4.测定细胞内ROS产生的量：(1)随着As2O3量的增加，细胞内ROS产生的量也是随之增加的，呈现出剂量依赖的关系。在给予5、10、20μmol/L的As2O3处理SMMC-7721细胞后，检测到的细胞内ROS的量，分别是对照组的1.2倍（P<0.05），2.1倍（P<0.01），3.2倍（P<0.01）。(2)随着As2O3量的增加，细胞内ROS产生的量也随之增加，呈现出剂量依赖的关系。在给予2、5、15μmol/L的As2O3处理HepG2细胞后，检测到的细胞内ROS的量，分别是对照组的1.1倍（P<0.05），1.8倍（P<0.01），3.2倍（P<0.01）。然而，当给予抗氧化剂NAC阻断之后，细胞内产生的ROS的量会减少，与高剂量组比较，细胞内ROS的量减少到高剂量组的0.33倍（P<0.01）。5.线粒体膜电位(△ψm)的测定：(1)随着As2O3用药量的增加，检测到的线粒体膜电位是呈下降的趋势，呈剂量依赖的关系。在给予5、10、20μmol/L的As2O3处理SMMC-7721细胞后，线粒体膜电位下降的量，分别是空白对照组的0.91倍（P<0.05），0.73倍（P<0.01），0.52倍（P<0.01）。(2)随着As2O3用药量的增加，检测到线粒体膜电位是下降趋势，呈剂量依赖的关系。在给予2、5、15μmol/L的As2O3处理HepG2细胞后，线粒体膜电位下降的量，分别是空白对照组的0.95倍（P<0.05），0.74倍（P<0.01），0.53倍（P<0.01）。然而，当给予抗氧化剂NAC阻断之后，线粒体膜电位减少的趋势则会被抑制，与高剂量组比较，线粒体膜电位上升的量是高剂量组的1.64倍（P<0.01）。6.Western Blot法检测细胞凋亡蛋白水平的表达显示：(1)在SMMC-7721细胞中，细胞内Bax/Bcl-2的比值随着As2O3浓度的增加而上调，具体而言，Bax蛋白的表达量上调，Bcl-2蛋白的表达量下调。同样，随着As2O3浓度的增加，细胞内cyt c、Smac、caspase-3、caspase-6、caspase-9蛋白的表达量均上调，呈剂量依赖关系，差异均具有统计学意义。(2)在HepG2肝癌细胞系中，检测细胞内caspase-3、caspase-6、caspase-9蛋白的表达，三种蛋白的表达均呈上升趋势，且呈剂量依赖性。然而，当加入抗氧化剂NAC之后，三种蛋白的表达量上升的趋势则被抑制。用Western Blot法检测cyt c、Smac的表达呈上升的趋势，Bax/Bcl-2的比值同样呈上升的趋势，Bax蛋白的表达量上调，Bcl-2蛋白的表达量下调，且呈剂量依赖性。然而，当加入抗氧化剂NAC之后，cyt c、Smac、Bax/Bcl-2表达量上升的趋势则被抑制。差异均具有统计学意义。【结论】1. As203可以抑制肝癌细胞的增殖，并且诱导肝癌细胞凋亡。2．As203诱导肝癌细胞凋亡，是通过ROS介导的线粒体通路。3．As203是通过调节相关蛋白的表达量，从而实现了诱导肝癌细胞的凋亡。