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目的：基于茵陈蒿汤、下瘀血汤、黄芪汤、一贯煎及小柴胡汤等不同功效古典方剂干预二甲基亚硝胺诱导大鼠肝硬化的效果,探讨方证病理学基础,比较不同方剂的作用特点,阐明有效方剂的作用机制。
方法：大鼠腹腔注射0.5％DMN 2ml·kg-1/次、4周(每周前3日1日1次、共12次)制备肝硬化模型,造模2周末取3只正常和6只模型大鼠作用药前观察,其余模型大鼠随机分为茵陈蒿汤组、下瘀血汤组、黄芪汤组、一贯煎组、小柴胡汤组及模型对照组；各用药组于继续造模每天同时给予不同方剂的煎出液(65kg体重成人日用量的8倍)经口灌胃2周,正常大鼠与模型对照组给予等剂量生理盐水,实验第4周末处死全部大鼠,获取样本,观察以下几个部分：
1.各组大鼠肝组织病理学(HE & Sirus red)、肝羟脯氨酸(Hyp)含量及肝功能；
2.各组大鼠肝组织氧化应激相关:MDA含量,GST、SOD及GSH活性；
3.免疫印迹检测:CD68/163、TNF-α、Fas、FasL、Bcl-2、Bax、Survivin、CytochromeC、Bcl-xL、Caspase-3/8/9/12、HGF-α、PCNA、TGF-β1(R),PDGF,MMP-13/14和TIMP-1/2蛋白表达；
4.Real-timePCR检测:CD68/163、TNF-α、Bax、IL-1/4/6/10、TLR-2/4、HO、CD14/36/53/44、α-SMA、Col-1(α)和TIMP-1/2mRNA水平变化；
5.免疫组化检测:CD68/163、Fas、Bcl-2、TIMP-1、TGF-β1、α-SMA、HGF-α和PCNA蛋白表达位置分布用免疫组化或免疫荧光检测；
6.明胶酶谱法检测:MMP-2/9活性；
7.激光共聚焦检测:Heppar、CD68、CD163和α-SMA分别与TUNEL共定位；CD68分别与CD163及α-SMA。
结果：
1.二甲基亚硝胺大鼠腹腔注射造模2周时已形成典型的肝纤维,持续造模至4周末75％大鼠已形成肝硬化,表明该模型3-4周为肝纤维化发展至肝硬化的病理阶段。以肝组织病理学与肝功能作综合判断,茵陈蒿汤为有效方剂,黄芪汤有一定的作用。
2.与正常组大鼠相比,模型大鼠肝组织MDA含量及GST活性均随模型进展显著升高,茵陈蒿汤和黄芪汤可以显著降低MDA含量(p<0.05/0.01);茵陈蒿汤和小柴胡汤可以降低GST活性(p<0.05)。SOD活性及GSH含量均随着模型进展显著降低(p<0.05),茵陈蒿汤、黄芪汤和一贯煎显著升高SOD活性(p<0.05/0.01);茵陈蒿汤和黄芪汤显著升高GSH含量(p<0.05/0.01)。
3.肝组织CD68和TNF-α蛋白表达均在2周最高,4周有一定程度的降低,与4周模型相比,茵陈蒿汤汤和下瘀血汤显著降低CD68蛋白表达(p<0.01),而黄芪汤却提高其表达(p<0.01);茵陈蒿汤、小柴胡汤和黄芪汤均显著降低TNF-α蛋白表达,以茵陈蒿汤最为显著。肝组织α-SMA和TGF-β随着模型进展而逐渐升高：茵陈蒿汤、小柴胡汤和黄芪汤均显著降低α-SMA和TGF-β蛋白表达,以茵陈蒿汤和黄芪汤效果最好。HGF-α蛋白表达,模型大鼠随着造模时间的进展而显著降低,在5首古典方剂中,黄芪汤和茵陈蒿汤显著提高其蛋白表达(p<0.01);以黄芪汤最为显著(p<0.01)。
4.正常组表达一定水平的Cytochrome C、Cleaved-caspase-9和PCNA,三者均在造模2周到达高峰；与2周模型组相比,DMN造模4周,这些蛋白表达显著下降(p<0.01);与4周模型组相比,茵陈蒿汤可以显著降低Cytochrome C、Cleaved-caspase-9和PCNA蛋白表达(p<0.01)。与此相反,Bcl-xL蛋白表达在2周模型组最低,4周模型组有一定程度的升高,与4周模型相比,茵陈蒿汤可以显著升高Bcl-xL蛋白表达(p<0.01);Pro-caspase-12随着模型进展逐步升高,Cleaved-caspase-12活性片段4周显著升高(p<0.01);与4周相比,茵陈蒿汤可以显著降低Pro/Cleaved-caspase-12蛋白表达(p<0.05/0.01)。
5.肝组织CD68免疫印迹、real-time PCR和免疫组化/免疫荧光均证明均已证明CD68在2周模型组表达最高,4周模型组有一定程度降低,与4周模型组相比,茵陈蒿汤可以显著降低CD68蛋白表达(p<0.01);肝组织CD163免疫印迹、Real-time PCR和免疫组化/免疫荧光均证明,CD163随着模型进展而逐步降低。与4周模型组相比,茵陈蒿汤显著升高CD163蛋白表达(p<0.01);TNF-α mRNA和蛋白表达结果表明,DMN造模2周,TNF-α mRNA即达到高峰,与2周模型相比,DMN造模4周TNF-αmRNA显著降低(p<0.01),茵陈蒿汤显著降低其表达。IFN-γ mRNA在DMN造模2周即达到高峰,为正常组的5.08倍,DMN造模4周,水平降至正常2.7倍；与4周模型组相比,茵陈蒿汤显著升高IFN-γ,mRNA表达(p<0.01)。
6.TUNEL染色发现：凋亡在正常组很低,DMN造模2周,凋亡细胞增至最多,DMN造模4周,凋亡细胞明显减少,与4周模型相比,茵陈蒿汤明显降低凋亡细胞。利用激光共聚焦发现：肝细胞凋亡可能并不是肝脏内主要凋亡细胞,因为用Hepatocyte Paraffin(Heppar)和TUNEL共定位结果发现Heppar和TUNEL双阳性细胞只占TUNEL其中一小部分。CD68和TUNEL共定位有大量的双阳性细胞,提示ED1KCs可能是主要的凋亡细胞。CD163/α-SMA与TUNEL共定位结果发现：没有明显的双阳性细胞发现,提示ED2 KCs和HSCs并不是肝脏主要凋亡细胞。
7.肝组织α-SMA/Col-(α)1 mRNA表达随着模型进展逐渐升高,与4周模型组相比,茵陈蒿汤显著降低α-SMA/Col-1(α)1mRNA表达(p<0.05/0.01)。TGF-β1免疫组化表明,正常表达较低,随着模型进展而逐步升高,与4周模型组相比,茵陈蒿汤显著降低TGF-β1蛋白表达；和TGF-β蛋白表达趋势相同,MMP-13/14蛋白表达同样随着模型的进展不断升高,茵陈蒿汤显著降低MMP-14蛋白表达(p<0.01)而显著升高MMP-13的表达(p<0.01)。 TGF-β1Receptor mRNA和蛋白印迹表明,基因和蛋白表达趋势并不完全一致。Real-time PCR结果表明：在DMN造模2周和4周有升高趋势,但无显著性差异,与4周模型组相比,茵陈蒿汤显著降低TGF-β1 Receptor mRNA表达(p<0.01)。TGF-β1Receptor免疫印迹结果发现：与正常相比,DMN造模2周,蛋白表达有降低趋势,造模4周显著升高(p<0.01);与4周模型组相比,茵陈蒿汤显著降低TGF-β1Receptor蛋白表达(p<0.01)。PDGF-BB和PDGF-B receptor免疫印迹和mRNA的结果表明：2者的表达趋势是一致的。随着造模时间的延长而逐步升高；茵陈蒿汤显著降低它们的表达(p<0.05)。
结论：
1.清热利湿的茵陈蒿汤显著抑制DMN所诱导的肝纤维化向肝硬化的发展,其他不同功效方剂：益气的黄芪汤、养阴的一贯煎、祛瘀的下瘀血汤及和解少阳清热益气的小柴胡汤均无此效应。提示DMN造模3-4周这一肝纤维化向肝硬化的发展阶段具备清热利湿茵陈蒿汤效应的方证病理学基础。
2.DMN大鼠慢性肝损伤模型3-4周这一阶段以CD68阳性KCs表达的显著增加以及过氧化损伤为重点的肝组织炎性反应是DMN大鼠慢性肝损伤的重要病理特征,是茵陈蒿汤发挥效应的关键病理生物学基础。
3.黄芪汤可显著抑制该模型阶段增高的TGF-β1、提高HGF以及抑制HSCs的活化,并具有一定的抗氧化效用,但同时促进CD68阳性KCs表达的增加。而后者可能是黄芪汤方证不对应未能呈现整体综合效应的病理生物学基础之一。