【目的】 矽肺是我国危害最严重的职业病之一，目前其发病机制仍不明确。矽肺最基本的病理变化是肺间质纤维化和矽结节的形成。与矽肺的发病相似，特发性肺纤维化(IPF)也是以肺成纤维细胞大量增殖为主要特征的肺纤维化疾病。两者的发病有着共同的特征，即持续性的肺泡炎症反应，以及各种炎前介质和致纤维化前介质的产生。提示两者在肺纤维化的发病过程中可能具有同源性。然而，相对于IPF及其他肺纤维化疾病而言，矽肺除了肺纤维化改变以外，还有其特征性的矽结节的形成。 支气管肺泡灌洗液(BALF)中的蛋白成分来源于气道及肺泡上皮表层，它能反映肺实质的病变过程。由于上述IPF、矽肺纤维化、矽结节等发病机制的复杂性，近年来，BALF中可溶性蛋白的蛋白质组学研究受到了关注，有关肺纤维化相关机制的研究已上升到细胞分子水平。 为了进一步探索与肺纤维化发生有关的细胞因子，本实验应用蛋白质组的双向电泳技术，浙江大学硕士学位论文—中文摘要孙健2004.5.对正常、IPF及矽肺BALF中的可溶性蛋白成分进行分离。并通过比较分析找出差异蛋白的信息，为下一步筛选、寻找及鉴定差异表达蛋白奠定基础，从而为阐明肺纤维化、矽结节形成机制提供新的思路。 【方法】 选用本校实验动物中心提供的清洁级健康成年雄性SD大鼠，随机分成3组。分别以0.9%的生理盐水lml、sm叭g的博来霉素和50m留ml的5102混悬液lml气管内灌注，制备正常、特发性肺纤维化及矽肺动物模型。通过支气管肺泡灌洗术获取三组大鼠的BALF样品，Folin一酚法测定样品中的蛋白含量。采用三氯乙酸(TCA)沉淀法提取大鼠BALF中蛋白样品，基本过程:取上述BALF样品加入TCA，使样品溶液的TCA终浓度为10%;混匀后冰浴20分钟，3500rpm离心1 smin;弃上清液，沉淀物以预冷的丙酮溶解，再次35oorpm离心巧min;倒弃丙酮，蛋白沉淀物风干几分钟后，以水化上样缓冲液充分溶解，超声混匀，40c下300009离心30min，保留上清液即为大鼠BALF蛋白样品。利用蛋白质组学的双向电泳技术，按180林g蛋白加样量(300林l的水化液)，以17em长的PH为3一10的线性IPG胶条进行第一相等电聚焦，再以12%505一队GE作第二相分离，分别对三组BALF中的蛋白质成分进行分离。运用凝胶分析软件PDQuest对所获取三组大鼠BALF的双向电泳图谱进行比较分析。数据的统计分析采用SPSS 11.0进行处理。【结果】 1.大鼠肺组织常规病理切片的形态学观察 常规病理切片显示正常对照组肺组织结构完整，肺泡壁均匀、清晰;IPF组可见肺组 织结构基本完整，肺泡壁增宽，胶原成分增多;矽肺组可见肺组织结构出现不同程度的破 坏，并出现典型的矽结节的改变，矽结节以细胞成分为主，其内胶原纤维增加。肺间质纤 维组织增生。2.各组BALF样品中蛋白含量的比较 三组BALF样品中蛋白含量测定结果显示:正常组为o.3196mglml、!pF组为0.3075mglml、矽肺组为1 .2775mglml。经单因素方差分析差别有显著意义(F二15.293:P<0.001)。与正常对照组比较，IPF组日ALF中蛋白含量无明显的统计学差异，而矽肺组BALF中蛋白质含量增高(P二0.002)。3.大鼠BALF的蛋白质2一DE图谱浙江大学硕士学位论文—中文摘要孙健.2004.5. 采用双向电泳技术分离蛋白质，以17cm长的pH为3一10的线性IPG胶条进行第一 相等电聚焦，再以12%垂直SDS一队GE作为第二相分离，获得了较清晰的正常、特发性 肺纤维化及矽肺大鼠BALF中蛋白质的双向电泳图谱。使用数字化ZD凝胶图像分析软件 PDQuest对所获取的蛋白质斑点进行分析，共获取蛋白斑点数为(450士63.2)个，其中正常 对照组的斑点数为(488士62.0)个，IPF组蛋白斑点为(469士42.2)个，矽肺组的蛋白质斑点 为(3 93士51.9)个。在所有的胶中共有123.3个蛋白斑点获得了完全匹配，而有349个蛋白 质斑点可以获得相对匹配。对同组的图谱进行匹配分析，在正常对照组共有387个点获得 了匹配，IPF组有355个点获得匹配，而矽肺组有306个点获得匹配。三组样品蛋白匹配 率分别为77.6%，75.3%及77%，获得较好的匹配。4.正常、IPF及矽肺大鼠BALF中蛋白质表达的差异 对三组样品中蛋白质差异斑点进行分析，发现其部分蛋白质斑点出现了质的变化，这 在图谱中主要表现为蛋白斑点的缺省、增加或位置的改变。相比正常组，仅出现在IPF组 和矽肺组的蛋白斑点有8个，而有31个蛋白斑点仅出现于正常对照组;相比IPF组与矽 肺组，有20个蛋白斑点仅出现在矽肺组，而有25个蛋白质斑点在矽肺组中缺失。 还有部分蛋白质斑点出现了量的差异，这些差异主要表现为斑点染色的深浅改变。统计 两组中出现5倍量差异的点共有98个，其中，相比正常组，有13个点在IPF组及矽肺组 中出现5倍量的增加;而有22个斑点却出现5倍量的减少。相比正常组和IPF组，有38 个蛋白斑点在矽肺组中出现5倍量的增加;而又有25个斑点在矽肺组中出现5倍量的减 少。5.通过网络蛋白质数据库的搜索获得一些初步的蛋白质信息 根据蛋白质斑点的分子量和等电点